【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病,以B細胞免疫耐受破壞、產(chǎn)生大量自身抗體為特征,最終免疫復(fù)合物沉積于組織、器官從而導(dǎo)致?lián)p傷。我國SLE患病率約為0.7~1/1000,且女性的發(fā)病率遠高于男性。盡管各類固有免疫和適應(yīng)性免疫細胞共同參與SLE的發(fā)病機制,根據(jù)目前小鼠和人的研究,B細胞免疫耐受破壞與自身反應(yīng)性B細胞異常激活仍是SLE發(fā)病的核心致病因素。SLE患者體內(nèi)B細胞亞群比例失調(diào),免疫穩(wěn)態(tài)存在紊亂,檢測其外周血B細胞亞群的比例和功能狀態(tài),可以深入探討不同B細胞亞群在SLE發(fā)病中的作用。SLE患者體內(nèi)存在大量的自身反應(yīng)性抗體分泌細胞(Antibody secreting cells,ASC)和高水平的自身抗體,并且ASC細胞的比例擴增會引起SLE疾病活動度的增高,然而這種致病性ASC細胞的來源和產(chǎn)生過程目前仍不清。無能B細胞(人外周血中的無能B細胞稱為B_(ND)細胞)是初始B細胞中富含自身反應(yīng)性的一個亞群,其通過下調(diào)表面免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)M來避免接受抗原刺激,從而達到免疫“無能”的狀態(tài)。此外,其胞內(nèi)的蛋白磷酸化水平和鈣流反應(yīng)性處于抑制狀態(tài)。多項研究表明無能B細胞在自身免疫疾病中缺失,提示著這群細胞可能發(fā)生激活并得到進一步分化。無能B細胞很可能是SLE患者致病性ASC細胞的潛在危險來源。免疫組庫測序(Adaptive immune receptor repertoire sequencing,AIRR-seq)是研究B細胞特征和抗體譜特點的重要方法,通過高通量測序方法分析B細胞受體(B cell receptor,BCR)序列可以探究適應(yīng)性免疫譜多樣性、克隆擴增和免疫譜成熟過程,進一步加深對SLE中異常免疫反應(yīng)的了解,也有助于尋找致病性的B細胞亞群。然而SLE患者體內(nèi)B細胞亞群的免疫組庫仍缺乏研究,IgM~-的B_(ND)細胞、IgM~+的初始B細胞(Conventional Na?ve B cells,CN B)免疫組庫特點和類型轉(zhuǎn)換的記憶B細胞(Switch Memory B cell,SM B)以及ASC細胞關(guān)系仍然未知。自身反應(yīng)性B細胞如何被激活并轉(zhuǎn)化為ASC細胞仍是有待于解決的重要難題。本課題首先通過流式細胞術(shù)檢測SLE患者B細胞亞群比例及其功能狀態(tài),探討各B細胞亞群在SLE發(fā)病中的意義。其次,通過分選IgM~+的CN B細胞、IgM~-的B_(ND)細胞、SM B細胞以及ASC細胞。并對4個B細胞亞群進行免疫組庫分析,進而探討SLE中4種細胞亞群的相互關(guān)系,協(xié)助尋找SLE中的致病性細胞產(chǎn)生來源和轉(zhuǎn)化過程。第一章SLE患者外周血中B細胞亞群的比例與功能研究目的:研究SLE患者B細胞不同亞群的比例與功能特點。方法:1.密度梯度離心法分離61例SLE患者和61例健康對照的外周血單個核細胞(Peripheral blood monocyte cells,PBMC),采用流式細胞術(shù)標(biāo)記不同B細胞亞群表面標(biāo)記,對各細胞亞群比例進行統(tǒng)計分析,并進行臨床相關(guān)性分析。2.采用流式細胞術(shù),檢測不同B細胞亞群表面CD21、CD40、CD80、CD24、CD95、CD183、白介素4受體(Interleukin 4 receptor,IL-4R)、B細胞激活因子受體(B-cell activating factor,BAFF-R)的表達。3.使用MitoTracker?Green探針標(biāo)記B細胞活化線粒體,判斷不同B細胞亞群線粒體活化狀態(tài)。4.檢測初始B細胞(CN B、B_(ND))在BCR刺激情況,胞內(nèi)鈣流水平的變化。結(jié)果:1.SLE患者B細胞亞群紊亂,雙陰性B細胞(Double negative B cell,DN B)、ASC、過渡性B細胞(Transitional B cells,Tr B)比例相對健康對照增多,非類型轉(zhuǎn)換的記憶B細胞(Unswitch-Memory B cells,UM B)、B_(ND)細胞比例相對健康對照比例減少,而初始B細胞、CN B、SM B細胞比例相對健康對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2.ASC細胞比例與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動度指數(shù)(Systemic lupus erythematosus activityindex,SLEDAI)、抗雙鏈DNA(Double-strand DNA,dsDNA)抗體滴度均呈顯著正相關(guān),B_(ND)細胞比例與SLEDAI、抗dsDNA滴度均呈顯著負相關(guān),Tr B細胞比例與抗dsDNA滴度呈顯著負相關(guān)。3.B_(ND)細胞相對CN B細胞活化標(biāo)志物CD21、CD80、CD95、CD183水平表達降低,CD40、BAFF-R表達相似,而IL-4R表達增加。4.SLE患者初始B細胞(CN B、B_(ND))相對健康對照線粒體活化程度增加。5.SLE患者B_(ND)細胞鈣流反應(yīng)相對健康對照增加。結(jié)論:SLE患者B_(ND)細胞比例相對健康對照降低,且與SLEDAI、抗dsDNA滴度呈顯著負相關(guān),是一群有重要臨床意義的細胞亞群。此外,SLE患者B_(ND)細胞相對健康對照線粒體活化程度增加、鈣流反應(yīng)增加,表明SLE患者B_(ND)細胞功能活化且對抗原刺激反應(yīng)性增高,提示SLE患者的B_(ND)細胞可能由于功能活化,存在一定程度的激活,引起比例減少。第二章SLE患者CN B、B_(ND)、SM B和ASC細胞亞群免疫組庫分析。方法:1.密度梯度離心法分離7例SLE患者和7例健康對照的PBMC,采用流式細胞術(shù)標(biāo)記不同B細胞亞群表面標(biāo)記。2.根據(jù)表面標(biāo)記,流式分選SLE患者和健康對照的IgM~+CN B、IgM~-B_(ND)、SM B和ASC細胞。3.Trizol法抽提不同細胞群RNA,進行反轉(zhuǎn)錄,并對重鏈進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴增,對PCR產(chǎn)物進行鑒定,回收目的片段條帶,對目的片段再次進行PCR擴增。4.對PCR產(chǎn)物進行二代測序,測序數(shù)據(jù)采用MIXCR和VDJtool軟件進行序列比對和統(tǒng)計分析。結(jié)果:1.健康人群CN B和B_(ND)細胞具有相似的IGHV基因,CN B、B_(ND)細胞IGHV4-34基因使用率均顯著高于SM B、ASC細胞;SLE患者SM B、ASC細胞相對健康對照IGHV4-34基因使用率增高。2.健康人群CN B細胞IGHJ6基因使用率低于B_(ND)細胞,CN B、B_(ND)細胞IGHJ6基因使用率均顯著高于SM B、ASC細胞;SLE患者B_(ND)細胞相對健康對照IGHJ6使用率減少,而ASC細胞相對健康對照增加。3.健康人群CN B細胞的互補決定區(qū)3(Complementary decision region 3,CDR3)長度短于B_(ND)細胞,CN B、B_(ND)細胞CDR3長度均長于SM B、ASC細胞。SLE患者B_(ND)細胞相對健康對照CDR3長度減少,而SM B細胞相對健康對照增加。結(jié)論:健康人群中B_(ND)細胞相對CN B細胞自身反應(yīng)性增加,表現(xiàn)在更高的IGHJ6基因使用率和更長的CDR3長度。從初始B細胞(CN B、B_(ND))轉(zhuǎn)變?yōu)镾M B、ASC細胞,機體的免疫耐受檢查點會對自身反應(yīng)性B細胞篩選,導(dǎo)致IGHV4-34基因使用率下降、IGHJ6基因使用率下降以及CDR3長度減少。我們的結(jié)果證明:SLE患者體內(nèi)免疫耐受檢查點缺陷,B_(ND)細胞亞群IGHJ6基因使用率低于健康對照、CDR3長度減少。而SM B和ASC細胞亞群IGHJ6、長CDR3等自身反應(yīng)性序列增加。提示部分B_(ND)亞群中的自身反應(yīng)性B細胞在SLE患者體內(nèi)可能發(fā)生激活,轉(zhuǎn)換為SM B或ASC細胞,成為致病性B細胞。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R593.241
【圖文】：

呈正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以 x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA檢驗，組間進一步兩兩比較采用Dunnt’t檢驗；偏態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，組間進一步兩兩比較采用Dunn's多重檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)（α）為0.05。五、實驗結(jié)果（一）B 細胞亞群流式設(shè)門方法在 CD19+的 B 細胞中，可根據(jù) CD27 和 IgD 分為 CD27-IgD+初始 B 細胞、CD27+IgD+UM B 細胞、CD27-IgD-DN B 細胞、CD27+IgD-B 細胞。初始 B 細胞中根據(jù) CD24 和 CD38 的表達劃分出 CD24hiCD38hiTr B 細胞與成熟初始 B 細胞，成熟的初始 B 細胞再根據(jù) IgM 的表達分為 IgM+初始 B 細胞 (Conventional Na ve B cells,CN B)、IgM-的 BND細胞。CD27+IgD-的 B 細胞中根據(jù) CD38 的表達劃分為 CD27+IgD-SM B 細胞和 CD27+CD38++ASC 細胞。B 細胞各亞群層次關(guān)系如圖右。

圖 3. SLE 患者各 B 細胞亞群比例與 SLEDAI、抗 dsDNA 抗體滴度相關(guān)性分析（A）SLE 患者各 B 細胞亞群與 SLEDAI 相關(guān)性分析。（B）SLE 患者各 B 細胞亞群與抗 dsDNA 抗體滴度相關(guān)性分析。（四）BND細胞亞群表型特點BND細胞是成熟的初始 B 細胞富含自身反應(yīng)性的細胞亞群，為了避免其激活，機體存在一種“無能”的機制，來降低表面 IgM 型 BCR。上述結(jié)果證明，BND細胞在 SLE患者發(fā)病中具有重要的意義。因此我們進一步分析 BND細胞亞群的表型特點。結(jié)果顯示：IgM-BND細胞相對 IgM+CN B 細胞低表達 CD21、CD80、CD95、CD183 等活化CD 分子，具有相對低活化的特征。CD40 和 BAFF-R 與 CN B 表達量相似，表明其具有一定被共刺激分子和 BAFF 細胞因子活化的能力，而其 IL-4R 表達量相對 CNB 細胞增高，提示 BND細胞可能易受 IL-4 的影響。

- 27 -圖5. SLE患者各B細胞亞群線粒體活化程度分析（A）SLE患者和健康對照各B細胞亞群T-SNE圖，每個點代表一個細胞，不同顏色代表不同亞群細胞，不同亞群聚集代表其CD分子特征相似（B）SLE患者和健康對照各

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 許曉強;邢志華;張巧花;;彌漫大B細胞淋巴瘤患者外周血可溶性白細胞介素-2受體 T細胞亞群及自然殺傷細胞檢測的臨床意義[J];中國藥物與臨床;2019年08期

2 張愛妹;萬引;;慢性阻塞性肺疾病患者T淋巴細胞亞群表達及意義分析[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2016年34期

3 薛揚;;恩替卡韋治療慢性重癥乙型肝炎的療效及對患者外周血T細胞亞群、肝功能的影響[J];北方藥學(xué);2017年01期

4 黃文娟;吳文忠;張云平;蘇倩倩;陳思思;;再生障礙性貧血患者T細胞亞群檢測的臨床意義[J];中外醫(yī)療;2017年05期

5 竇文靜;;恩替卡韋治療慢性重癥乙型肝炎的療效及對外周血T細胞亞群、肝功能的影響[J];北方藥學(xué);2017年03期

6 李曉輝;翁智勝;彭潔雯;易江華;廖夢怡;辛甜甜;;T淋巴細胞亞群與帶狀皰疹臨床特征的相關(guān)分析[J];廣東醫(yī)學(xué);2017年S2期

7 王志剛;;外周血T細胞亞群檢測在惡性腫瘤中的價值[J];中外醫(yī)療;2012年05期

8 端木和運;韋生坤;;肺結(jié)核患者外周血腺苷脫氨酶活性與T淋巴細胞亞群定量檢測的相關(guān)性及臨床意義[J];實用臨床醫(yī)藥雜志;2012年19期

9 聶振華;李俊艷;孔祥君;;復(fù)發(fā)性念珠菌性包皮龜頭炎患者外周血T細胞亞群變化的臨床意義[J];山東醫(yī)藥;2011年25期

10 沈興華;陳興年;;肺結(jié)核患者外周血T淋巴細胞亞群的臨床分析[J];臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志;2010年19期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉震天;李柏青;陳策;江京娣;唐潔;;健康人與肺結(jié)核患者外周血PBMC中γδT細胞亞群免疫表型的比較[A];第十屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會匯編[C];2015年

2 高麗霞;劉斌;張p

本文編號：2796202