【摘要】:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病,以B細(xì)胞免疫耐受破壞、產(chǎn)生大量自身抗體為特征,最終免疫復(fù)合物沉積于組織、器官從而導(dǎo)致?lián)p傷。我國SLE患病率約為0.7~1/1000,且女性的發(fā)病率遠(yuǎn)高于男性。盡管各類固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞共同參與SLE的發(fā)病機(jī)制,根據(jù)目前小鼠和人的研究,B細(xì)胞免疫耐受破壞與自身反應(yīng)性B細(xì)胞異常激活仍是SLE發(fā)病的核心致病因素。SLE患者體內(nèi)B細(xì)胞亞群比例失調(diào),免疫穩(wěn)態(tài)存在紊亂,檢測其外周血B細(xì)胞亞群的比例和功能狀態(tài),可以深入探討不同B細(xì)胞亞群在SLE發(fā)病中的作用。SLE患者體內(nèi)存在大量的自身反應(yīng)性抗體分泌細(xì)胞(Antibody secreting cells,ASC)和高水平的自身抗體,并且ASC細(xì)胞的比例擴(kuò)增會引起SLE疾病活動度的增高,然而這種致病性ASC細(xì)胞的來源和產(chǎn)生過程目前仍不清。無能B細(xì)胞(人外周血中的無能B細(xì)胞稱為B_(ND)細(xì)胞)是初始B細(xì)胞中富含自身反應(yīng)性的一個亞群,其通過下調(diào)表面免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)M來避免接受抗原刺激,從而達(dá)到免疫“無能”的狀態(tài)。此外,其胞內(nèi)的蛋白磷酸化水平和鈣流反應(yīng)性處于抑制狀態(tài)。多項(xiàng)研究表明無能B細(xì)胞在自身免疫疾病中缺失,提示著這群細(xì)胞可能發(fā)生激活并得到進(jìn)一步分化。無能B細(xì)胞很可能是SLE患者致病性ASC細(xì)胞的潛在危險(xiǎn)來源。免疫組庫測序(Adaptive immune receptor repertoire sequencing,AIRR-seq)是研究B細(xì)胞特征和抗體譜特點(diǎn)的重要方法,通過高通量測序方法分析B細(xì)胞受體(B cell receptor,BCR)序列可以探究適應(yīng)性免疫譜多樣性、克隆擴(kuò)增和免疫譜成熟過程,進(jìn)一步加深對SLE中異常免疫反應(yīng)的了解,也有助于尋找致病性的B細(xì)胞亞群。然而SLE患者體內(nèi)B細(xì)胞亞群的免疫組庫仍缺乏研究,IgM~-的B_(ND)細(xì)胞、IgM~+的初始B細(xì)胞(Conventional Na?ve B cells,CN B)免疫組庫特點(diǎn)和類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞(Switch Memory B cell,SM B)以及ASC細(xì)胞關(guān)系仍然未知。自身反應(yīng)性B細(xì)胞如何被激活并轉(zhuǎn)化為ASC細(xì)胞仍是有待于解決的重要難題。本課題首先通過流式細(xì)胞術(shù)檢測SLE患者B細(xì)胞亞群比例及其功能狀態(tài),探討各B細(xì)胞亞群在SLE發(fā)病中的意義。其次,通過分選IgM~+的CN B細(xì)胞、IgM~-的B_(ND)細(xì)胞、SM B細(xì)胞以及ASC細(xì)胞。并對4個B細(xì)胞亞群進(jìn)行免疫組庫分析,進(jìn)而探討SLE中4種細(xì)胞亞群的相互關(guān)系,協(xié)助尋找SLE中的致病性細(xì)胞產(chǎn)生來源和轉(zhuǎn)化過程。第一章SLE患者外周血中B細(xì)胞亞群的比例與功能研究目的:研究SLE患者B細(xì)胞不同亞群的比例與功能特點(diǎn)。方法:1.密度梯度離心法分離61例SLE患者和61例健康對照的外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood monocyte cells,PBMC),采用流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記不同B細(xì)胞亞群表面標(biāo)記,對各細(xì)胞亞群比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并進(jìn)行臨床相關(guān)性分析。2.采用流式細(xì)胞術(shù),檢測不同B細(xì)胞亞群表面CD21、CD40、CD80、CD24、CD95、CD183、白介素4受體(Interleukin 4 receptor,IL-4R)、B細(xì)胞激活因子受體(B-cell activating factor,BAFF-R)的表達(dá)。3.使用MitoTracker?Green探針標(biāo)記B細(xì)胞活化線粒體,判斷不同B細(xì)胞亞群線粒體活化狀態(tài)。4.檢測初始B細(xì)胞(CN B、B_(ND))在BCR刺激情況,胞內(nèi)鈣流水平的變化。結(jié)果:1.SLE患者B細(xì)胞亞群紊亂,雙陰性B細(xì)胞(Double negative B cell,DN B)、ASC、過渡性B細(xì)胞(Transitional B cells,Tr B)比例相對健康對照增多,非類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞(Unswitch-Memory B cells,UM B)、B_(ND)細(xì)胞比例相對健康對照比例減少,而初始B細(xì)胞、CN B、SM B細(xì)胞比例相對健康對照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.ASC細(xì)胞比例與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動度指數(shù)(Systemic lupus erythematosus activityindex,SLEDAI)、抗雙鏈DNA(Double-strand DNA,dsDNA)抗體滴度均呈顯著正相關(guān),B_(ND)細(xì)胞比例與SLEDAI、抗dsDNA滴度均呈顯著負(fù)相關(guān),Tr B細(xì)胞比例與抗dsDNA滴度呈顯著負(fù)相關(guān)。3.B_(ND)細(xì)胞相對CN B細(xì)胞活化標(biāo)志物CD21、CD80、CD95、CD183水平表達(dá)降低,CD40、BAFF-R表達(dá)相似,而IL-4R表達(dá)增加。4.SLE患者初始B細(xì)胞(CN B、B_(ND))相對健康對照線粒體活化程度增加。5.SLE患者B_(ND)細(xì)胞鈣流反應(yīng)相對健康對照增加。結(jié)論:SLE患者B_(ND)細(xì)胞比例相對健康對照降低,且與SLEDAI、抗dsDNA滴度呈顯著負(fù)相關(guān),是一群有重要臨床意義的細(xì)胞亞群。此外,SLE患者B_(ND)細(xì)胞相對健康對照線粒體活化程度增加、鈣流反應(yīng)增加,表明SLE患者B_(ND)細(xì)胞功能活化且對抗原刺激反應(yīng)性增高,提示SLE患者的B_(ND)細(xì)胞可能由于功能活化,存在一定程度的激活,引起比例減少。第二章SLE患者CN B、B_(ND)、SM B和ASC細(xì)胞亞群免疫組庫分析。方法:1.密度梯度離心法分離7例SLE患者和7例健康對照的PBMC,采用流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記不同B細(xì)胞亞群表面標(biāo)記。2.根據(jù)表面標(biāo)記,流式分選SLE患者和健康對照的IgM~+CN B、IgM~-B_(ND)、SM B和ASC細(xì)胞。3.Trizol法抽提不同細(xì)胞群RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并對重鏈進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴(kuò)增,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,回收目的片段條帶,對目的片段再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4.對PCR產(chǎn)物進(jìn)行二代測序,測序數(shù)據(jù)采用MIXCR和VDJtool軟件進(jìn)行序列比對和統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:1.健康人群CN B和B_(ND)細(xì)胞具有相似的IGHV基因,CN B、B_(ND)細(xì)胞IGHV4-34基因使用率均顯著高于SM B、ASC細(xì)胞;SLE患者SM B、ASC細(xì)胞相對健康對照IGHV4-34基因使用率增高。2.健康人群CN B細(xì)胞IGHJ6基因使用率低于B_(ND)細(xì)胞,CN B、B_(ND)細(xì)胞IGHJ6基因使用率均顯著高于SM B、ASC細(xì)胞;SLE患者B_(ND)細(xì)胞相對健康對照IGHJ6使用率減少,而ASC細(xì)胞相對健康對照增加。3.健康人群CN B細(xì)胞的互補(bǔ)決定區(qū)3(Complementary decision region 3,CDR3)長度短于B_(ND)細(xì)胞,CN B、B_(ND)細(xì)胞CDR3長度均長于SM B、ASC細(xì)胞。SLE患者B_(ND)細(xì)胞相對健康對照CDR3長度減少,而SM B細(xì)胞相對健康對照增加。結(jié)論:健康人群中B_(ND)細(xì)胞相對CN B細(xì)胞自身反應(yīng)性增加,表現(xiàn)在更高的IGHJ6基因使用率和更長的CDR3長度。從初始B細(xì)胞(CN B、B_(ND))轉(zhuǎn)變?yōu)镾M B、ASC細(xì)胞,機(jī)體的免疫耐受檢查點(diǎn)會對自身反應(yīng)性B細(xì)胞篩選,導(dǎo)致IGHV4-34基因使用率下降、IGHJ6基因使用率下降以及CDR3長度減少。我們的結(jié)果證明:SLE患者體內(nèi)免疫耐受檢查點(diǎn)缺陷,B_(ND)細(xì)胞亞群IGHJ6基因使用率低于健康對照、CDR3長度減少。而SM B和ASC細(xì)胞亞群IGHJ6、長CDR3等自身反應(yīng)性序列增加。提示部分B_(ND)亞群中的自身反應(yīng)性B細(xì)胞在SLE患者體內(nèi)可能發(fā)生激活,轉(zhuǎn)換為SM B或ASC細(xì)胞,成為致病性B細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】:中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2019
【分類號】:R593.241
【圖文】:
呈正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料以 x±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用ANOVA檢驗(yàn),組間進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnt’t檢驗(yàn);偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)(下四分位數(shù),上四分位數(shù))表示,兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn),組間進(jìn)一步兩兩比較采用Dunn's多重檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(一)B 細(xì)胞亞群流式設(shè)門方法在 CD19+的 B 細(xì)胞中,可根據(jù) CD27 和 IgD 分為 CD27-IgD+初始 B 細(xì)胞、CD27+IgD+UM B 細(xì)胞、CD27-IgD-DN B 細(xì)胞、CD27+IgD-B 細(xì)胞。初始 B 細(xì)胞中根據(jù) CD24 和 CD38 的表達(dá)劃分出 CD24hiCD38hiTr B 細(xì)胞與成熟初始 B 細(xì)胞,成熟的初始 B 細(xì)胞再根據(jù) IgM 的表達(dá)分為 IgM+初始 B 細(xì)胞 (Conventional Na ve B cells,CN B)、IgM-的 BND細(xì)胞。CD27+IgD-的 B 細(xì)胞中根據(jù) CD38 的表達(dá)劃分為 CD27+IgD-SM B 細(xì)胞和 CD27+CD38++ASC 細(xì)胞。B 細(xì)胞各亞群層次關(guān)系如圖右。

圖 3. SLE 患者各 B 細(xì)胞亞群比例與 SLEDAI、抗 dsDNA 抗體滴度相關(guān)性分析(A)SLE 患者各 B 細(xì)胞亞群與 SLEDAI 相關(guān)性分析。(B)SLE 患者各 B 細(xì)胞亞群與抗 dsDNA 抗體滴度相關(guān)性分析。(四)BND細(xì)胞亞群表型特點(diǎn)BND細(xì)胞是成熟的初始 B 細(xì)胞富含自身反應(yīng)性的細(xì)胞亞群,為了避免其激活,機(jī)體存在一種“無能”的機(jī)制,來降低表面 IgM 型 BCR。上述結(jié)果證明,BND細(xì)胞在 SLE患者發(fā)病中具有重要的意義。因此我們進(jìn)一步分析 BND細(xì)胞亞群的表型特點(diǎn)。結(jié)果顯示:IgM-BND細(xì)胞相對 IgM+CN B 細(xì)胞低表達(dá) CD21、CD80、CD95、CD183 等活化CD 分子,具有相對低活化的特征。CD40 和 BAFF-R 與 CN B 表達(dá)量相似,表明其具有一定被共刺激分子和 BAFF 細(xì)胞因子活化的能力,而其 IL-4R 表達(dá)量相對 CNB 細(xì)胞增高,提示 BND細(xì)胞可能易受 IL-4 的影響。

- 27 -圖5. SLE患者各B細(xì)胞亞群線粒體活化程度分析(A)SLE患者和健康對照各B細(xì)胞亞群T-SNE圖,每個點(diǎn)代表一個細(xì)胞,不同顏色代表不同亞群細(xì)胞,不同亞群聚集代表其CD分子特征相似(B)SLE患者和健康對照各
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