發(fā)布時(shí)間：2020-08-15 07:40

【摘要】：背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在機(jī)體內(nèi)環(huán)境因子的影響下,可能并不能有效發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,反而成為具有致炎作用的細(xì)胞。目前關(guān)于MSC在自身免疫病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中的作用報(bào)道不一。瓜氨酸化纖維蛋白原(cfb)是RA患者體內(nèi)存在的一種重要的自身抗原。近年來,研究證實(shí)cfb可以作為Toll樣受體(TLR)的內(nèi)源性配體即損傷相關(guān)分子模式(DAMP)參與RA的發(fā)病。MSC表達(dá)多種功能性的TLR,但是cfb是否可以作為MSC的DAMP,從而影響MSC的致炎作用和免疫調(diào)節(jié)功能,目前尚未見到相關(guān)報(bào)道。目的：本研究旨在探討RA中特異的自身抗原cfb對(duì)骨髓MSC (BMSC)的致炎作用和免疫調(diào)節(jié)功能的影響,并探究其中相關(guān)的分子機(jī)制；進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入闡明cfb對(duì)BMSC的影響及其在關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用。此外,本研究還以臍帶MSC (UC-MSC)作為觀察對(duì)象,觀察cfb對(duì)這群細(xì)胞致炎作用和免疫調(diào)節(jié)功能的影響。方法：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)RA患者與健康對(duì)照者血清中抗cfb抗體的水平,將RA患者血清中的抗cfb抗體水平與患者的關(guān)節(jié)炎活動(dòng)評(píng)分(DAS28)或血清中致炎性細(xì)胞因子水平進(jìn)行相關(guān)性分析,進(jìn)一步明確cfb在RA發(fā)病過程中的病理意義。從RA患者及其對(duì)照骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者的關(guān)節(jié)置換術(shù)中取得骨髓,分離培養(yǎng)BMSC。觀察cfb刺激對(duì)RA或者OA的BMSC細(xì)胞功能的影響,以未修飾的纖維蛋白原(fb)刺激作為對(duì)照組、未刺激的BMSC作為空白對(duì)照組。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)與ELISA分別檢測(cè)各組致炎性細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、CCL2、IL-1 β與TNFα)的基因及蛋白水平。PCR與流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞TLR4的基因及蛋白表達(dá)水平。免疫印跡法(WB)檢BMSC中NFκB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,并在抗原刺激實(shí)驗(yàn)中加入TLR4中和抗體或NFκB信號(hào)通路的抑制劑,明確TLR4-NFκB信號(hào)通路是否參與cfb誘導(dǎo)的致炎作用。觀察cfb是否影響B(tài)MSC的免疫調(diào)節(jié)功能,采用cfb預(yù)處理的BMSC與外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng),FCM檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖與活化情況；將不同處理組的BMSC與Th17細(xì)胞分化體系共培養(yǎng),觀察cfb是否干擾BMSC對(duì)Th17細(xì)胞的抑制作用。PCR檢測(cè)各組BMSC中免疫調(diào)節(jié)分子Jagged1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)與吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)的表達(dá)。牛Ⅱ型膠原(CⅡ)免疫注射DBA/1小鼠制作膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型,小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病(免疫注射后第28天)后靜脈輸注人BMSC (1×106/只)或者cfb預(yù)處理的人BMSC(1×106/只),以未處理的模型組作為對(duì)照組、未造模的正常小鼠組作為空白對(duì)照組。觀察各組小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分,三周后處死小鼠,留取踝關(guān)節(jié)行HE病理染色。FCM檢測(cè)各組小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞亞群的比例。ELISA檢測(cè)各組小鼠血清中抗CⅡ抗體和炎性細(xì)胞因子水平。結(jié)果：RA患者血清中抗cfb抗體水平顯著高于健康對(duì)照組,而抗fb抗體水平在兩組之間并沒有顯著差異。RA患者的抗cfb抗體水平與DAS28評(píng)分、抗CCP抗體水平及致炎性細(xì)胞因子(如CCL2)水平均存在正相關(guān)性�？乖璫fb較fb能夠更顯著地增加BMSC中致炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8與CCL2的mRNA及蛋白水平,但cfb與fb兩者均不影響B(tài)MSC中IL-1β與TNFα的表達(dá)。然而,抗原cfb誘導(dǎo)OA與RA兩種不同來源BMSC的致炎效應(yīng)并沒有顯著不同�？乖璫fb處理不影響B(tài)MSC中TLR4的表達(dá),但是cfb可以活化下游NFKB信號(hào)通路相關(guān)蛋白如p-p65與p-IKBα。阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)cfb是通過TLR4-NFκB信號(hào)通路的介導(dǎo)促使BMSC產(chǎn)生致炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8與CCL2。此外,抗原cfb明顯減弱BMSC的免疫調(diào)節(jié)功能包括對(duì)PBMC增殖、活化的調(diào)節(jié)作用及對(duì)Th17細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)；cfb不影響B(tài)MSC表達(dá)Jagged1與TGF-β1,但可以明顯干擾BMSC表達(dá)免疫調(diào)節(jié)分子IDO,并且亦可能是通過TLR4的介導(dǎo)。在CIA體內(nèi),與未處理的BMSC相比,cfb預(yù)處理的BMSC不能有效下調(diào)Th17細(xì)胞,對(duì)機(jī)體內(nèi)炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用亦減弱。cfb對(duì)UC-MSC致炎效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能的影響并不顯著,可能與這群細(xì)胞中TLR4的基礎(chǔ)表達(dá)量低有關(guān)。結(jié)論：通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,RA中特異存在的致病抗原cfb促進(jìn)BMSC的致炎作用并負(fù)向調(diào)節(jié)其免疫抑制功能。cfb可作為RA內(nèi)環(huán)境中的危險(xiǎn)信號(hào),影響B(tài)MSC功能進(jìn)而參與RA的炎癥反應(yīng)與疾病進(jìn)展。本研究同時(shí)提示cfb可以不經(jīng)由傳統(tǒng)的抗原提呈途徑而是直接作用于機(jī)體細(xì)胞參與RA的發(fā)病。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.22
【圖文】：

邐南京大學(xué)博±研巧生學(xué)位論文邐逡逑統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ＲＡ患者血清抗Ｃ化抗體水平與臨床或?qū)嶒?yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析采用逡逑Ｓｐｅａｒｍａｎ邋方法。逡逑結(jié)果逡逑１．１邐ＲＡ患者血清中抗￡化抗體水平較健康人顯著上升逡逑ＥＬＩＳＡ檢測(cè)ＲＡ患者及對(duì)照}D健康人血清中抗纖維蛋白原抗體（ａｎｔｉ－化Ａｂ）和逡逑抗瓜氨酸化纖維蛋白原抗體（ａｎｔｉNB化Ａｂ）的結(jié)果顯示，ＲＡ患者血清中的抗化抗逡逑體檢測(cè)的０Ｄ值（１．８１±０．０４，邋ｎ＝４５）與健康人（１．８６±０．０３，ｎ＝４５）無顯著差異逡逑（戶＝０．３７），但是ＲＡ患者血清中抗Ｃ化抗體的ＯＤ值顯著高于健康對(duì)照組［２．９９邋±逡逑０．０６邋（打＝４５）邋Ｗ邋２．７０邋±０．０２邐（ｎ＝４５），ｆＯ．ＯＯｌ］（圖邋１－１）。逡逑’，‘一一

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本文編號(hào)：2793817