【摘要】：糖尿病是一組常見的慢性代謝內(nèi)分泌疾病,按其病因臨床上可分為1型糖尿病和2型糖尿病,其中2型糖尿病約占90%。隨著糖尿病發(fā)病的年輕化及患病率的不斷上升,其已成為21世紀全球面臨的最嚴重、最危急的健康問題之一。糖尿病患病人數(shù)逐年遞增,并產(chǎn)生影響終生的并發(fā)癥,致殘致死率高,已成為我國乃至全球最沉重的疾病負擔。目前糖尿病并無有效的治愈手段,如何對其預(yù)防和控制已成為全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題,應(yīng)對2型糖尿病的挑戰(zhàn)應(yīng)當關(guān)口前移、防治結(jié)合。糖尿病的發(fā)生發(fā)展主要由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定,糖尿病70%-90%的危險度可歸因于不良的環(huán)境暴露,膳食作為其中的重要因素,合理的膳食干預(yù)成為遏制糖尿病的最有效手段之一。膳食因素中除了有益的營養(yǎng)元素,也存在諸多致病因素。在食品的生產(chǎn)加工過程中,熱加工是最常見的方式,其為食物帶來獨特的風(fēng)味和誘人的色澤,亦可延長食品的儲存期限。然而熱加工的美拉德反應(yīng)也產(chǎn)生諸多有害物質(zhì),晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products,AGEs)就是其中一種。AGEs在日常膳食中廣泛存在,其暴露無法避免。目前研究認為,長期暴露于高AGEs飲食將促進炎癥,影響心血管系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng),從而導(dǎo)致肥胖、糖尿病,并加快糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。由于目前AGEs膳食數(shù)據(jù)庫仍不完善,且缺乏精確的定量手段,限制了大規(guī)模流行病學(xué)的開展。國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)以及美國糖尿病協(xié)會(ADA)目前還沒有關(guān)于AGEs的膳食建議,探討AGEs與2型糖尿病進展的大樣本人群研究證據(jù)仍然缺乏。隨著色譜和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對生物樣本的AGEs水平進行評估受到廣泛推崇,使得基于生物標志物的大樣本人群研究成為可能。AGEs在人體內(nèi)的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受多種受體影響,其中最關(guān)鍵的是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE),其可能介導(dǎo)了 AGEs大部分的不良健康效應(yīng)。編碼RAGE的基因AGER的單核苷酸多態(tài)性與RAGE的功能和多種代謝性疾病存在關(guān)聯(lián)。AGEs-RAGE信號軸是目前研究的熱點。近年來,精準醫(yī)療受到各界的廣泛關(guān)注,探討個體在不同遺傳背景下的暴露因素和疾病結(jié)局的關(guān)系符合精準醫(yī)療的理念。鑒于膳食暴露是機體AGES的重要來源,其在體內(nèi)的累積通過RAGE信號軸引起一系列級聯(lián)反應(yīng),從而促進糖尿病等諸多慢性病的發(fā)生發(fā)展。本研究擬建立一套穩(wěn)定可靠的UPLC-MS/MS檢測手段,同時檢測生物樣本中多種來源的AGEs基于病例-對照研究,進一步探討多種AGEs生物標志物與2型糖尿病的關(guān)系;探討AGEs可溶性受體(sRAGE)作為重要的臨床生物標志物,其在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用,并深入闡述AGER基因多態(tài)性對標志物和疾病結(jié)局的交互作用。本研究的主要內(nèi)容涵蓋以下三個部分第一部分人血漿中晚期糖基化終末產(chǎn)物定量檢測方法的建立目的:通過建立一套預(yù)處理簡便、高靈敏度、高通量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry UPLC-MS/MS),對人血漿中不同來源的AGEs進行定量檢測方法:應(yīng)用Agilent 1200SL超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Agilent 6460三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀對血漿五種游離型AGEs進行靶向定量檢測分析,離子源為電離子噴霧(ESI with Agilent Jet Stream)。掃描模式采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。我們對樣本前處理、色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)分別進行了優(yōu)化以期達到最佳靈敏度和分離效果,并參照歐洲藥品管理局的生物分析方法驗證指南對本分析方法進行驗證結(jié)果:樣本前處理采用乙腈-甲醇(1:3)進行蛋白沉淀。經(jīng)質(zhì)譜和液相參數(shù)優(yōu)化后,分析物(CML、CEL、CMC、MG-H1、Pyr)和相應(yīng)內(nèi)標在正模式下進行多反應(yīng)監(jiān)測,優(yōu)化后的分析物定量離子對分別為205.1→84.1(CML)、219.1→84(CEL)、180.0→89.0(CMC)、229.1→70.1(MG-H1)、255.1 →148.1(Pyr)色譜分離采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(型號:2.lmm×100mm,1.8μm),以乙腈-5mM九氟戊酸水溶液為流動相進行梯度洗脫。進樣量設(shè)定為10μL,單樣本分析時間為14分鐘。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示,各目標物質(zhì)分離效果好,出峰時間無明顯內(nèi)源性干擾存在。校正曲線具有良好的線性,四個不同濃度的質(zhì)控樣本的日內(nèi)和日間精密度均在15%以內(nèi),精確度均在±15%范圍內(nèi),不同濃度水平的平均提取回收率均在85%-115%之間。穩(wěn)定性試驗表明,三個濃度水平的質(zhì)控樣本分別在室溫放置24小時、反復(fù)凍融3次和低溫(-80℃)放置1年時間三種條件下各類AGEs物質(zhì)均有較好的穩(wěn)定性結(jié)論:本研究建立了人血漿游離型AGEs的UPLC-MS/MS定量檢測方法,該方法前處理簡便,靈敏度高,具有較好的穩(wěn)定性和可靠性,為本課題后續(xù)基于生物標志物的流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分血漿晚期糖基化終末產(chǎn)物與2型糖尿病及糖調(diào)節(jié)受損的關(guān)聯(lián)性研究目的:基于已建立的UPLC-MS/MS方法,對血漿樣本的多種游離型AGEs定量檢測,進行血漿AGEs暴露與糖尿病的關(guān)聯(lián)性研究。方法:基于病例-對照研究設(shè)計,根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999年糖尿病診斷標準,共納入836例新診斷2型糖尿病(T2DM)、515例糖調(diào)節(jié)受損(IGR)以及1214例正常對照組。研究對象的社會人口學(xué)資料、生活習(xí)慣以及疾病史通過標準化問卷獲取,人體測量指標以及生化指標由專業(yè)人員進行檢測。血漿游離型AGEs通過已建立的UPLC-MS/MS方法進行定量分析。通過多因素邏輯回歸探討多種AGEs以及AGE評分與T2DM及IGR的關(guān)聯(lián)。結(jié)果:各血漿游離型AGEs(CML、CEL、CMC、MG-H1)在NGT、IGR及T2DM中的水平均呈現(xiàn)遞增趨勢,Pyr在NGT、IGR和T2DM三組間并無顯著差異。調(diào)整潛在的混雜因素后,血漿各AGEs每增加一個標準差(SD),T2DM的OR(95%CI)分別為:CML,1.40(1.26-1.56)、CEL,1.54(1.38-1.73)、CMC,1.81(1.60-2.06)、MG-H1,1.14(1.02-1.27)。各AGEs與IGR的關(guān)聯(lián)也得到類似的結(jié)果,調(diào)整混雜因素后,各AGEs每增加一個SD,其OR(95%CI)分別為:CML,1.21(1.08-1.36)、CEL,1.09(0.97-1.22)、CMC,1.40(1.25-1.57)、MG-H1,1.05(0.94-1.18),其效應(yīng)值與AGES-T2DM的效應(yīng)值相比有所減弱。AGEs評分每增加一分,T2DM的OR(95%CI)為2.70(2.20-3.32),IGR的OR(95%CI)為 1.52(1.22-1.88)。結(jié)論:本研究表明多種AGEs以及整體AGEs負荷水平與T2DM和IGR存在正相關(guān),并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。第三部分血漿晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)性研究目的:探討血漿可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(sRAGE)與2型糖尿病(T2DM)及糖調(diào)節(jié)受損(IGR)的關(guān)聯(lián);探索編碼晚期糖基化終末產(chǎn)物特異性受體的基因AGER的基因多態(tài)性在sRAGE與糖尿病中的作用。方法:該部分基于病例-對照研究設(shè)計,根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999年糖尿病診斷標準,共納入1360例新診斷2型糖尿病(T2DM)、859例糖調(diào)節(jié)受損(IGR)以及2495例正常對照組。所有受試者來源于2012年至2015年期間在湖北省武漢市華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌門診進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)的人群。研究對象基本信息通過標準化問卷獲取,人體測量指標以及生化指標由專業(yè)人員進行檢測。血漿sRAGE通過ELISA試劑盒檢測,通過現(xiàn)有文獻和1000 Genomes數(shù)據(jù)庫篩選基因位點,基因分型采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(Agena MassArray system)進行。結(jié)果:血漿sRAGE水平在T2DM組、IGR組和正常對照組中分別為879.2(643.0-1214.9),908.3(678.6-1198.3),1075.7(772.3-1436.8)pg/mL。T2DM組和IGR組血漿sRAGE水平顯著低于對照組(P0.001)。限制性三次樣條回歸模型中,血漿sRAGE濃度與T2DM及IGR風(fēng)險呈現(xiàn)負相關(guān),趨近于線性劑量-效應(yīng)關(guān)系。Logistic回歸結(jié)果顯示,在調(diào)整社會人口學(xué)、生活方式、糖尿病家族史及疾病史等混雜因素后,血漿sRAGE水平每增加一個標準差(SD),人群患T2DM和IGR的ORs值分別為0.70(95%CI:0.64-0.76),0.79(95%CI:0.73-0.87)。在各亞組分析中,血漿sRAGE水平與T2DM患病風(fēng)險的負關(guān)聯(lián)關(guān)系依然穩(wěn)定存在,且在不吸煙的人群中sRAGE的保護作用更強(P for interaction=0.04)。AGER基因第三外顯子的錯義突變rs2070600的TT攜帶者與CC攜帶者比,T2DM的OR為0.65(95%CI:0.43-0.97)。與CC攜帶者且具有最低sRAGE水平的人群相比,TT攜帶者且具有最高sRAGE水平的人群患T2DM的風(fēng)險最低(P for interaction=0.02)。結(jié)論:本研究表明血漿sRAGE水平與T2DM和IGR的患病風(fēng)險呈現(xiàn)負相關(guān),這種關(guān)聯(lián)與AGERrs2070600存在交互作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1
【圖文】：

均與ＩＧＲ雖ＩＥ相關(guān)，其效應(yīng)值與ＡＧＥＳ－Ｔ２ＤＭ的效應(yīng)值相比有所減弱。通過廣義逡逑相加模型，調(diào)整潛在的混雜囡素后，各ＡＧＥｓ與Ｔ２ＤＭ及ＩＧＲ的患病率平滑曲線逡逑分別見圖２－２及圖２－３。可見隨著各游離型ＡＧＥｓ水平的增加，Ｔ２ＤＭ及ＩＧＲ罹患逡逑率呈現(xiàn)上升趨勢，ＪＬ不同種類的ＡＧＥｓ與Ｔ２ＤＭ和ＩＧＲ的關(guān)聯(lián)存在差異。逡逑３５逡逑

血漿ｓＲＡＧＥ與ＭＤＡ及ＨＯＭＡ－ＩＲ均呈現(xiàn)負相關(guān)，與尿酸、血脂四項等無逡逑關(guān)。基于廣義相加模型，我們繪制了邋ｓＲＡＧＥ與ＭＤＡ和ＨＯＭＡ－ＩＲ的曲線擬合逡逑圖，并調(diào)整潛在的混雜因素（圖３－２）�？梢婋S著血漿ｓＲＡＧＥ升高，機體脂質(zhì)逡逑過氧化水平（ＭＤＡ）和胰島素抵抗水平（ＨＯＭＡ－ＩＲ）下降。該現(xiàn)象可能解釋ｓＲＡＧＥ逡逑與Ｔ２ＤＭ和ＩＧＲ風(fēng)險呈現(xiàn)負相關(guān)的潛在機制。逡逑表３－４．在ＮＧＴ、Ｔ２ＤＭ及ＩＧＲ人群中，血漿ｓＲＡＧＥ水平與脂質(zhì)過氧化指標、逡逑胰島素抵抗、尿酸、血脂等的多因素線性回歸分析邐逡逑邐ＮＧＴ邐Ｔ２ＤＭ邐ＩＧＲ逡逑ＭＤＡ邋（［ｊ，ｍｏｌ／Ｌ）逡逑Ｎｏｎ－ａｄｊｕｓｔｅｄ邐－０．０５＋０．０３＊邐－０．１４＋０．０５＊邐－０．０７＋０．０２＊＊逡逑Ａｄｊｕｓｔｅｄ邐－０．０６＋０．０３＊邐－０．１３＋０．０６＊邐－０．０５＋０．０２＊逡逑ＨＯＭＡ－ＩＲ逡逑Ｎｏｎ－ａｄｊｕｓｔｅｄ邐－０．２１＋０．０３＊＊＊邐－０．３２＋０．１０＊＊邐－０．３２＋０．０９＊＊＊逡逑Ａｄｊｕｓｔ

邐■邋ｓＲＡＧＥ邋Ｔｅｒｔｉｌｅ邋２邐■邋ｓＲＡＧＥ邋Ｔｅｒｔｉｌｅ邋３逡逑圖３－３．邋ＮＧＴ及Ｔ２ＤＭ的血漿ｓＲＡＧＥ水平在不同ｒｓ２０７０６００基因型的分布。血漿逡逑ｓＲＡＧＥ表示為中位數(shù)（四分位間距）逡逑＿逡逑圖３－４．血漿ｓＲＡＧＥ水平與ｒｓ２０７０６００基因多態(tài)性在Ｔ２ＤＭ中的交互作用。模型逡逑調(diào)整了性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、飲酒、運動、糖尿病家族史、高血壓、高脂血癥、逡逑脂肪肝等混雜因素。逡逑６４逡逑

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本文編號：2789008