【摘要】：糖尿病是一組常見(jiàn)的慢性代謝內(nèi)分泌疾病,按其病因臨床上可分為1型糖尿病和2型糖尿病,其中2型糖尿病約占90%。隨著糖尿病發(fā)病的年輕化及患病率的不斷上升,其已成為21世紀(jì)全球面臨的最嚴(yán)重、最危急的健康問(wèn)題之一。糖尿病患病人數(shù)逐年遞增,并產(chǎn)生影響終生的并發(fā)癥,致殘致死率高,已成為我國(guó)乃至全球最沉重的疾病負(fù)擔(dān)。目前糖尿病并無(wú)有效的治愈手段,如何對(duì)其預(yù)防和控制已成為全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題,應(yīng)對(duì)2型糖尿病的挑戰(zhàn)應(yīng)當(dāng)關(guān)口前移、防治結(jié)合。糖尿病的發(fā)生發(fā)展主要由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定,糖尿病70%-90%的危險(xiǎn)度可歸因于不良的環(huán)境暴露,膳食作為其中的重要因素,合理的膳食干預(yù)成為遏制糖尿病的最有效手段之一。膳食因素中除了有益的營(yíng)養(yǎng)元素,也存在諸多致病因素。在食品的生產(chǎn)加工過(guò)程中,熱加工是最常見(jiàn)的方式,其為食物帶來(lái)獨(dú)特的風(fēng)味和誘人的色澤,亦可延長(zhǎng)食品的儲(chǔ)存期限。然而熱加工的美拉德反應(yīng)也產(chǎn)生諸多有害物質(zhì),晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products,AGEs)就是其中一種。AGEs在日常膳食中廣泛存在,其暴露無(wú)法避免。目前研究認(rèn)為,長(zhǎng)期暴露于高AGEs飲食將促進(jìn)炎癥,影響心血管系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng),從而導(dǎo)致肥胖、糖尿病,并加快糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。由于目前AGEs膳食數(shù)據(jù)庫(kù)仍不完善,且缺乏精確的定量手段,限制了大規(guī)模流行病學(xué)的開(kāi)展。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)以及美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)目前還沒(méi)有關(guān)于AGEs的膳食建議,探討AGEs與2型糖尿病進(jìn)展的大樣本人群研究證據(jù)仍然缺乏。隨著色譜和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對(duì)生物樣本的AGEs水平進(jìn)行評(píng)估受到廣泛推崇,使得基于生物標(biāo)志物的大樣本人群研究成為可能。AGEs在人體內(nèi)的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受多種受體影響,其中最關(guān)鍵的是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE),其可能介導(dǎo)了 AGEs大部分的不良健康效應(yīng)。編碼RAGE的基因AGER的單核苷酸多態(tài)性與RAGE的功能和多種代謝性疾病存在關(guān)聯(lián)。AGEs-RAGE信號(hào)軸是目前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái),精準(zhǔn)醫(yī)療受到各界的廣泛關(guān)注,探討個(gè)體在不同遺傳背景下的暴露因素和疾病結(jié)局的關(guān)系符合精準(zhǔn)醫(yī)療的理念。鑒于膳食暴露是機(jī)體AGES的重要來(lái)源,其在體內(nèi)的累積通過(guò)RAGE信號(hào)軸引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而促進(jìn)糖尿病等諸多慢性病的發(fā)生發(fā)展。本研究擬建立一套穩(wěn)定可靠的UPLC-MS/MS檢測(cè)手段,同時(shí)檢測(cè)生物樣本中多種來(lái)源的AGEs基于病例-對(duì)照研究,進(jìn)一步探討多種AGEs生物標(biāo)志物與2型糖尿病的關(guān)系;探討AGEs可溶性受體(sRAGE)作為重要的臨床生物標(biāo)志物,其在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用,并深入闡述AGER基因多態(tài)性對(duì)標(biāo)志物和疾病結(jié)局的交互作用。本研究的主要內(nèi)容涵蓋以下三個(gè)部分第一部分人血漿中晚期糖基化終末產(chǎn)物定量檢測(cè)方法的建立目的:通過(guò)建立一套預(yù)處理簡(jiǎn)便、高靈敏度、高通量的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry UPLC-MS/MS),對(duì)人血漿中不同來(lái)源的AGEs進(jìn)行定量檢測(cè)方法:應(yīng)用Agilent 1200SL超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Agilent 6460三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀對(duì)血漿五種游離型AGEs進(jìn)行靶向定量檢測(cè)分析,離子源為電離子噴霧(ESI with Agilent Jet Stream)。掃描模式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。我們對(duì)樣本前處理、色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)分別進(jìn)行了優(yōu)化以期達(dá)到最佳靈敏度和分離效果,并參照歐洲藥品管理局的生物分析方法驗(yàn)證指南對(duì)本分析方法進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果:樣本前處理采用乙腈-甲醇(1:3)進(jìn)行蛋白沉淀。經(jīng)質(zhì)譜和液相參數(shù)優(yōu)化后,分析物(CML、CEL、CMC、MG-H1、Pyr)和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)在正模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè),優(yōu)化后的分析物定量離子對(duì)分別為205.1→84.1(CML)、219.1→84(CEL)、180.0→89.0(CMC)、229.1→70.1(MG-H1)、255.1 →148.1(Pyr)色譜分離采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(型號(hào):2.lmm×100mm,1.8μm),以乙腈-5mM九氟戊酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)樣量設(shè)定為10μL,單樣本分析時(shí)間為14分鐘。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示,各目標(biāo)物質(zhì)分離效果好,出峰時(shí)間無(wú)明顯內(nèi)源性干擾存在。校正曲線(xiàn)具有良好的線(xiàn)性,四個(gè)不同濃度的質(zhì)控樣本的日內(nèi)和日間精密度均在15%以?xún)?nèi),精確度均在±15%范圍內(nèi),不同濃度水平的平均提取回收率均在85%-115%之間。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明,三個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣本分別在室溫放置24小時(shí)、反復(fù)凍融3次和低溫(-80℃)放置1年時(shí)間三種條件下各類(lèi)AGEs物質(zhì)均有較好的穩(wěn)定性結(jié)論:本研究建立了人血漿游離型AGEs的UPLC-MS/MS定量檢測(cè)方法,該方法前處理簡(jiǎn)便,靈敏度高,具有較好的穩(wěn)定性和可靠性,為本課題后續(xù)基于生物標(biāo)志物的流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分血漿晚期糖基化終末產(chǎn)物與2型糖尿病及糖調(diào)節(jié)受損的關(guān)聯(lián)性研究目的:基于已建立的UPLC-MS/MS方法,對(duì)血漿樣本的多種游離型AGEs定量檢測(cè),進(jìn)行血漿AGEs暴露與糖尿病的關(guān)聯(lián)性研究。方法:基于病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì),根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),共納入836例新診斷2型糖尿病(T2DM)、515例糖調(diào)節(jié)受損(IGR)以及1214例正常對(duì)照組。研究對(duì)象的社會(huì)人口學(xué)資料、生活習(xí)慣以及疾病史通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷獲取,人體測(cè)量指標(biāo)以及生化指標(biāo)由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)。血漿游離型AGEs通過(guò)已建立的UPLC-MS/MS方法進(jìn)行定量分析。通過(guò)多因素邏輯回歸探討多種AGEs以及AGE評(píng)分與T2DM及IGR的關(guān)聯(lián)。結(jié)果:各血漿游離型AGEs(CML、CEL、CMC、MG-H1)在NGT、IGR及T2DM中的水平均呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),Pyr在NGT、IGR和T2DM三組間并無(wú)顯著差異。調(diào)整潛在的混雜因素后,血漿各AGEs每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(SD),T2DM的OR(95%CI)分別為:CML,1.40(1.26-1.56)、CEL,1.54(1.38-1.73)、CMC,1.81(1.60-2.06)、MG-H1,1.14(1.02-1.27)。各AGEs與IGR的關(guān)聯(lián)也得到類(lèi)似的結(jié)果,調(diào)整混雜因素后,各AGEs每增加一個(gè)SD,其OR(95%CI)分別為:CML,1.21(1.08-1.36)、CEL,1.09(0.97-1.22)、CMC,1.40(1.25-1.57)、MG-H1,1.05(0.94-1.18),其效應(yīng)值與AGES-T2DM的效應(yīng)值相比有所減弱。AGEs評(píng)分每增加一分,T2DM的OR(95%CI)為2.70(2.20-3.32),IGR的OR(95%CI)為 1.52(1.22-1.88)。結(jié)論:本研究表明多種AGEs以及整體AGEs負(fù)荷水平與T2DM和IGR存在正相關(guān),并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。第三部分血漿晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及其基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)性研究目的:探討血漿可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(sRAGE)與2型糖尿病(T2DM)及糖調(diào)節(jié)受損(IGR)的關(guān)聯(lián);探索編碼晚期糖基化終末產(chǎn)物特異性受體的基因AGER的基因多態(tài)性在sRAGE與糖尿病中的作用。方法:該部分基于病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì),根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),共納入1360例新診斷2型糖尿病(T2DM)、859例糖調(diào)節(jié)受損(IGR)以及2495例正常對(duì)照組。所有受試者來(lái)源于2012年至2015年期間在湖北省武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌門(mén)診進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)的人群。研究對(duì)象基本信息通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷獲取,人體測(cè)量指標(biāo)以及生化指標(biāo)由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)。血漿sRAGE通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè),通過(guò)現(xiàn)有文獻(xiàn)和1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)篩選基因位點(diǎn),基因分型采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(Agena MassArray system)進(jìn)行。結(jié)果:血漿sRAGE水平在T2DM組、IGR組和正常對(duì)照組中分別為879.2(643.0-1214.9),908.3(678.6-1198.3),1075.7(772.3-1436.8)pg/mL。T2DM組和IGR組血漿sRAGE水平顯著低于對(duì)照組(P0.001)。限制性三次樣條回歸模型中,血漿sRAGE濃度與T2DM及IGR風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),趨近于線(xiàn)性劑量-效應(yīng)關(guān)系。Logistic回歸結(jié)果顯示,在調(diào)整社會(huì)人口學(xué)、生活方式、糖尿病家族史及疾病史等混雜因素后,血漿sRAGE水平每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(SD),人群患T2DM和IGR的ORs值分別為0.70(95%CI:0.64-0.76),0.79(95%CI:0.73-0.87)。在各亞組分析中,血漿sRAGE水平與T2DM患病風(fēng)險(xiǎn)的負(fù)關(guān)聯(lián)關(guān)系依然穩(wěn)定存在,且在不吸煙的人群中sRAGE的保護(hù)作用更強(qiáng)(P for interaction=0.04)。AGER基因第三外顯子的錯(cuò)義突變r(jià)s2070600的TT攜帶者與CC攜帶者比,T2DM的OR為0.65(95%CI:0.43-0.97)。與CC攜帶者且具有最低sRAGE水平的人群相比,TT攜帶者且具有最高sRAGE水平的人群患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)最低(P for interaction=0.02)。結(jié)論:本研究表明血漿sRAGE水平與T2DM和IGR的患病風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),這種關(guān)聯(lián)與AGERrs2070600存在交互作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1
【圖文】：

均與ＩＧＲ雖ＩＥ相關(guān)，其效應(yīng)值與ＡＧＥＳ－Ｔ２ＤＭ的效應(yīng)值相比有所減弱。通過(guò)廣義逡逑相加模型，調(diào)整潛在的混雜囡素后，各ＡＧＥｓ與Ｔ２ＤＭ及ＩＧＲ的患病率平滑曲線(xiàn)逡逑分別見(jiàn)圖２－２及圖２－３�？梢�(jiàn)隨著各游離型ＡＧＥｓ水平的增加，Ｔ２ＤＭ及ＩＧＲ罹患逡逑率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，ＪＬ不同種類(lèi)的ＡＧＥｓ與Ｔ２ＤＭ和ＩＧＲ的關(guān)聯(lián)存在差異。逡逑３５逡逑

血漿ｓＲＡＧＥ與ＭＤＡ及ＨＯＭＡ－ＩＲ均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與尿酸、血脂四項(xiàng)等無(wú)逡逑關(guān)�；趶V義相加模型，我們繪制了邋ｓＲＡＧＥ與ＭＤＡ和ＨＯＭＡ－ＩＲ的曲線(xiàn)擬合逡逑圖，并調(diào)整潛在的混雜因素（圖３－２）�？梢�(jiàn)隨著血漿ｓＲＡＧＥ升高，機(jī)體脂質(zhì)逡逑過(guò)氧化水平（ＭＤＡ）和胰島素抵抗水平（ＨＯＭＡ－ＩＲ）下降。該現(xiàn)象可能解釋?zhuān)螅遥粒牵佩义吓cＴ２ＤＭ和ＩＧＲ風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的潛在機(jī)制。逡逑表３－４．在ＮＧＴ、Ｔ２ＤＭ及ＩＧＲ人群中，血漿ｓＲＡＧＥ水平與脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)、逡逑胰島素抵抗、尿酸、血脂等的多因素線(xiàn)性回歸分析邐逡逑邐ＮＧＴ邐Ｔ２ＤＭ邐ＩＧＲ逡逑ＭＤＡ邋（［ｊ，ｍｏｌ／Ｌ）逡逑Ｎｏｎ－ａｄｊｕｓｔｅｄ邐－０．０５＋０．０３＊邐－０．１４＋０．０５＊邐－０．０７＋０．０２＊＊逡逑Ａｄｊｕｓｔｅｄ邐－０．０６＋０．０３＊邐－０．１３＋０．０６＊邐－０．０５＋０．０２＊逡逑ＨＯＭＡ－ＩＲ逡逑Ｎｏｎ－ａｄｊｕｓｔｅｄ邐－０．２１＋０．０３＊＊＊邐－０．３２＋０．１０＊＊邐－０．３２＋０．０９＊＊＊逡逑Ａｄｊｕｓｔ

邐■邋ｓＲＡＧＥ邋Ｔｅｒｔｉｌｅ邋２邐■邋ｓＲＡＧＥ邋Ｔｅｒｔｉｌｅ邋３逡逑圖３－３．邋ＮＧＴ及Ｔ２ＤＭ的血漿ｓＲＡＧＥ水平在不同ｒｓ２０７０６００基因型的分布。血漿逡逑ｓＲＡＧＥ表示為中位數(shù)（四分位間距）逡逑＿逡逑圖３－４．血漿ｓＲＡＧＥ水平與ｒｓ２０７０６００基因多態(tài)性在Ｔ２ＤＭ中的交互作用。模型逡逑調(diào)整了性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、飲酒、運(yùn)動(dòng)、糖尿病家族史、高血壓、高脂血癥、逡逑脂肪肝等混雜因素。逡逑６４逡逑

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本文編號(hào)：2789008