【摘要】：背景:急性心梗對心肌的破壞包括缺血損傷和再灌注損傷兩部分。在過去二十年里,大量的研究都將關(guān)注點聚焦在心肌細胞的再灌注病理損傷機制中,而忽視了心肌上游的微循環(huán)破壞。而在微循環(huán)穩(wěn)態(tài)調(diào)控中,線粒體起著不可替代的作用。線粒體通過自身的損傷性分裂和保護性自噬清除,對再灌注損傷信號進行修飾,將胞外信號傳遞給內(nèi)皮細胞,介導(dǎo)內(nèi)皮的凋亡或存活,從而精確調(diào)節(jié)微循環(huán)的結(jié)構(gòu)和功能。但現(xiàn)在仍不清楚的是,線粒體分裂和線粒體自噬是如何調(diào)控微循環(huán)再灌注損傷。不僅如此,近期的研究證實了線粒體分裂過程主要受到線粒體分裂因子(Mff)的調(diào)控,而Mff介導(dǎo)的損傷性線粒體分裂是如何通過下游事件最終啟動內(nèi)皮凋亡也沒有詳細的實驗報道;除此之外,FUNDC1是新型的線粒體自噬調(diào)節(jié)受體,而FUNDC1激活的保護性線粒體自噬是如何維持線粒體穩(wěn)態(tài)和內(nèi)皮功能,還未見報道。最后,我們前期研究證實了 NR4A1參與到代謝性肝損傷的線粒體分裂和自噬調(diào)控中,而NR4A1是否有能力在心肌再灌注損傷條件下,差異性調(diào)節(jié)線粒體分裂和自噬還不得而知。目的:本研究旨在闡明心肌缺血再灌注介導(dǎo)微循環(huán)損傷的分子機制,探究Mff介導(dǎo)的線粒體分裂誘發(fā)微循環(huán)破壞的信號過程,明確FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬修復(fù)微循環(huán)損傷的保護機制,尋找線粒體分裂和線粒體自噬的上游調(diào)節(jié)信號。方法:利用WT小鼠、NR4A1敲除小鼠(NR4A1KO)以及Mff敲除小鼠MffK-o體外建立心肌再灌注損傷模型。同時從上述老鼠心臟組織中分離心肌微循環(huán)內(nèi)皮細胞(CMEC),在體外建立缺氧復(fù)氧損傷模型。動物水平,利用免疫組化、免疫熒光、western blot、免疫共沉淀、qPCR、超微結(jié)構(gòu)電鏡等實驗方法,觀察微循環(huán)舒張功能、屏障功能、管腔結(jié)構(gòu)、內(nèi)皮凋亡等變化;細胞水平,利用線粒體提取、qPCR技術(shù)、熒光探針、western blot、病毒過表達、突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、干擾RNA敲低、電鏡、免疫熒光共定位染色、免疫共沉淀、高效薄層色譜法等技術(shù),觀察線粒體DNA轉(zhuǎn)錄和表達、能量代謝、線粒體ROS生成、線粒體cyt-c滲出、心磷脂氧化、線粒體膜電位、mPTP開放、HK2解離、線粒體和溶酶體融合(線粒體自噬)、線粒體分裂、線粒體凋亡通路等變化。從而明確NR4A1對微循環(huán)再灌注損傷的調(diào)控作用、闡明Mff介導(dǎo)的線粒體分裂誘發(fā)內(nèi)皮死亡的具體過程、確立FUNDC1調(diào)控的線粒體自噬,保護線粒體穩(wěn)態(tài)和內(nèi)皮活性的信號機制。結(jié)果:1.再灌注條件下,NR4A1在微循環(huán)中的表達含量顯著上升,而敲除NR4A1后可以顯著降低微循環(huán)灌注缺損和內(nèi)皮凋亡。2.結(jié)構(gòu)功能上,抑制NR4A1后可以恢復(fù)內(nèi)皮的屏障功能、舒張功能并減輕局部炎癥反應(yīng)。3.分子水平上,NR4A1促進Mff的磷酸化激活,從而誘發(fā)線粒體過度分裂;NR4A1下調(diào)FUNDC1的活性,進而壓制線粒體自噬;4.線粒體分裂的激活和線粒體自噬的失活,共同促進了內(nèi)皮細胞死亡和微循環(huán)再灌注損傷密切相關(guān)。5.機制上,Mff調(diào)控的線粒體分裂,也可通過誘發(fā)線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄和表達下調(diào),從而造成線粒體ROS的大量蓄積,誘發(fā)心磷脂的氧化,促進凋亡因子細胞色素c(cyt-c)的釋放。6.不僅如此,Mff調(diào)控的線粒體分裂,也會通過誘發(fā)線粒體外膜VDAC1蛋白的寡聚化,從而促進抗凋亡因子HK2的解離,造成mPTP的持續(xù)開放,加速cyt-c向胞漿滲漏。7.滲漏至胞漿的cyt-c可以通過啟動線粒體凋亡通路,激活內(nèi)皮細胞的自殺程序。8.而在體水平敲除Mff,可以減輕內(nèi)皮細胞凋亡、對抗微循環(huán)再灌注損傷。9.與損傷性線粒體分裂相反,FUNDC1介導(dǎo)的線粒體自噬,可以通過促進線粒體碎片的清除,糾正過度的線粒體分裂,封閉線粒體凋亡通路,最終促進內(nèi)皮存活。結(jié)論:1.再灌注損傷通過上調(diào)NR4A1,誘發(fā)內(nèi)皮線粒體的損傷以及微循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能的破壞;2.異常表達的NR4A1通過提高Mff的磷酸化,從而激活損傷性線粒體分裂;3.高表達的NR4A1通過限制FUNDC1的激活,從而壓制保護性線粒體自噬;4.Mff介導(dǎo)的線粒體分裂,通過激活mROS/cardiolipin/cyt-c和VDAC1/HK2/mPTP信號通路,最終促進cyt-c向胞漿滲漏,啟動線粒體依賴的內(nèi)皮死亡,加重微循環(huán)再灌注損傷;5.FUNDC1調(diào)控的線粒體自噬,通過清除線粒體碎片,對抗線粒體分裂,從而維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能,降低再灌注內(nèi)皮損傷,維持微循環(huán)穩(wěn)態(tài)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R54
【圖文】：

ＩＬ５邐ＩＬ６邐ＣＸＣＬ１邐ＳＥＲＰＩＮＢ２邐ＰＬＡ２Ｇ７邐ＨＡＶＣＲ２逡逑ＤＰＰ１０逡逑３．５血標(biāo)本懫集及全血ＤＮＡ提�。哄义涎獦�(biāo)本懫集前與受試者本人簽署知情同意書，均于空腹時抽取外周靜脈血，逡逑５ｍｌ靜脈血收集于ＥＤＴＡ真空負壓抗凝管中，混勻后平均分裝于５支凍存管并逡逑保存于－８０°Ｃ凍存?zhèn)溆�，提取全血ＤＮＡ。待所有受試者�?biāo)本集齊后，應(yīng)用天根生逡逑化公司的血液基因組提取試劑盒（貨號：ＤＰ邋３４８）抽提全血ＤＮＡ，操作步驟按說逡逑明書進行，懫集的全血ＤＮＡ存于１．５ｍｌ邋ＥＰ管中并于－２０°Ｃ保存。干冰運輸送檢逡逑行目標(biāo)區(qū)域高通量測序（委托第三方４若禾致源生物信息科技有限公司進行）。逡逑３．６．目標(biāo)區(qū)域捕獲聯(lián)合二代高通量測序流程：逡逑諾禾致源公司首先對送檢的ＤＮＡ樣品進行檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳分析逡逑及Ｑｕｂｉｔ熒光計精確定量，對于ＤＮＡ含量在０．５ｕｇ以上的樣品被用來建庫捕獲、逡逑文庫質(zhì)檢并進入Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋Ｈｉｓｅｑ邋２０００平臺高通量測序流程，測序流程如圖１－１－１。逡逑邐邐邐＂邐＇

邐解放軍醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文邐逡逑３．６．１．測序標(biāo)本質(zhì)檢：逡逑（１）邐應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法分析ＤＮＡ完整性及純度；逡逑檢測參數(shù)：逡逑基因組ＤＮＡ—膠濃度：１％電壓：１００ｖ電泳時間：４０ｍｉｎ逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物——膠濃度：２％邋電壓：８０ｖ邐電泳時間：５０ｍｉｎ逡逑ｌ0ｘ邋ｌｉｂｒａｒｙ－－－膠濃度：１％邋電壓：６ｖ邋電泳時間：１８ｈ逡逑凝膠電泳檢測結(jié)果：如圖１－１－２。逡逑

邐解放軍醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文邐逡逑盒所推薦實驗用品及操作流程進行，實驗基本流程見圖１－１－３。逡逑３．６．３．上機測序：應(yīng)用設(shè)計的Ａｇｉｌｅｎｔ液相芯片目標(biāo)區(qū)域捕獲探針，對獲得的逡逑ＤＮＡ序列進行高效富集，隨后在ＩｌｌＵｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００平臺測序。目標(biāo)區(qū)域捕獲逡逑探針＋測序工作流程見圖１－１－３。逡逑ＤＮＡ逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2788648