【摘要】：目的:我們發(fā)現(xiàn)無機砷可抑制過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ),激活細胞自噬過程,同時�；撬峥娠@著激活PPARγ并抑制自噬過程,但牛磺酸緩解胰島素抵抗的作用機制和靶標尚不清楚。因此,本研究擬探索牛磺酸對砷所致胰島素抵抗進行營養(yǎng)干預(yù)的可行性及可能機制。方法:體內(nèi)實驗中,以C57BL/6J雄性小鼠為研究對象,通過自由飲水的方式暴露于濃度為1~4 mg/L的三氧化二砷(As2O3),�；撬岜Ｗo組在自由飲用濃度為4 mg/L的As2O3基礎(chǔ)之上,每天用250 mg/kg�；撬峁辔�,為期12周。12周后,行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)檢測小鼠葡萄糖耐受能力;測量小鼠肝臟重量;制作肝臟石蠟切片,用糖原染色法(PAS染色)檢測肝組織中糖原合成情況,用免疫熒光技術(shù)檢測肝組織中磷酸化蛋白激酶C(p-Akt)蛋白的表達;用實時定量PCR(RT-PCR)檢測肝組織中糖異生基因葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6pase)、果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1,6-bisphosphatase,FBPase)、叉頭框蛋白(Forkhead box protein O1,FOXO1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)以及糖酵解基因L-型丙酮酸激酶(L-pyruvate kinase,L-PK)和葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)的表達;用免疫蛋白印記法(Western blot)檢測糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)、糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2)以及通路相關(guān)蛋白Akt、p-Akt、PPARγ的表達情況。體外實驗中,以人HepG2細胞為研究對象。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測不同濃度亞砷酸鈉(Na As O_2)處理后的HepG2細胞存活率的變化;1~4μM Na As O_2作用HepG2細胞24 h,用Western blot檢測HepG2細胞中通路相關(guān)蛋白PPARγ、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2(mTORC2)、Akt、p-Akt、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、P62/SQSTM1蛋白的表達水平;預(yù)先使用PPARγ激活劑羅格列酮(RGS)、mTORC2激活劑棕櫚酸鹽(PA)、自噬小體形成抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和�；撬崽幚砗�,用4μM濃度的Na As O_2作用HepG2細胞24 h。用Western blot檢測HepG2細胞中通路相關(guān)蛋白PPARγ、mTORC2、Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、P62以及糖代謝相關(guān)蛋白GSK3β、p-GSK3β、GLUT2的表達情況;用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測HepG2細胞中葡萄糖攝取量。結(jié)果:暴露于濃度為1~4 mg/L的As2O3后,小鼠肝臟重量顯著減輕,而�；撬岜Ｗo組小鼠肝臟重量與高濃度染毒組(單純暴露于As2O3,濃度為4 mg/L)相比顯著增高;OGTT結(jié)果顯示,在0、15、30、120 min時,高濃度染毒組小鼠血糖明顯高于對照組且具有統(tǒng)計學差異,�；撬岣深A(yù)后血糖水平下降且具有統(tǒng)計學差異。葡萄糖口服耐量測試血糖曲線下面積(OGTT-AUC)結(jié)果顯示As2O3暴露可引起葡萄糖耐量異常,牛磺酸干預(yù)后可緩解As2O3引起的葡萄糖耐量異常;PAS染色結(jié)果顯示,肝組織糖原含量隨著As2O3染毒濃度的增加而顯著減少,而�；撬岜Ｗo組中肝組織糖原含量與高濃度染毒組相比顯著增加;RT-PCR結(jié)果顯示肝組織糖異生基因表達隨As2O3染毒濃度的增加而增加,糖酵解基因表達隨As2O3染毒濃度的增加而減少。同上,�；撬岜Ｗo組保護作用明顯,與高濃度染毒組相比,�；撬岜Ｗo組中糖異生基因表達減少而糖酵解基因表達有所增加;Western blot結(jié)果顯示隨著As2O3染毒濃度的增加,肝組織中PPARγ、p-Akt和GLUT2蛋白表達顯著減少,p-GSK3β蛋白表達顯著增加,免疫熒光結(jié)果進一步驗證肝組織p-Akt表達隨As2O3染毒濃度的增加而減少,與高濃度染毒組相比,�；撬岜Ｗo組的保護作用顯著,差別有統(tǒng)計學意義。在體外實驗中,用不同濃度NaAsO_2作用HepG2細胞24 h,細胞存活率隨Na As O_2染毒濃度的增加而降低;1~4μM Na As O_2作用HepG2細胞24 h,Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,PPARγ、mTORC2、p-Akt和LC3-Ⅱ蛋白表達降低,P62蛋白表達增加。加入RGS和�；撬犷A(yù)處理后,PPARγ蛋白表達與染毒組(單純暴露于Na As O_2,濃度為4μM)相比有顯著增加。加入RGS、PA和牛磺酸預(yù)處理后,mTORC2和p-Akt蛋白表達與染毒組相比有顯著增加。加入RGS、PA、3-MA和�；撬犷A(yù)處理后,LC3-Ⅱ和p-GSK3β蛋白表達與染毒組相比有顯著降低,P62和GLUT2表達與之相反;葡萄糖氧化酶-過氧化物酶測定結(jié)果顯示,在HepG2細胞中,與對照組相比,染毒組培基中的葡萄糖含量增加。加入RGS、PA、3-MA和�；撬岣深A(yù)后,與染毒組相比,培基中的葡萄糖含量有所減少,提示細胞攝取葡萄糖能力增加。結(jié)論:�；撬嵬ㄟ^PPARγ-mTORC2通路調(diào)控自噬緩解砷所致胰島素抵抗。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1;R595
【圖文】：

19圖 1As2O3對小鼠肝臟糖代謝的影響以及�；撬岬谋Ｗo作用1~4 mg/kg As2O3處理 C57BL/6J 小鼠 12 周，�；撬岜Ｗo組小鼠在 4 mg/kg As2O3染毒基礎(chǔ)上每天用 250mg/kg 牛磺酸進行灌胃。（A）小鼠肝臟重量。（B-C）小鼠 OGTT 以及小鼠 OGTT-AUC。n=7，條圖以均值±標準差來表示，* 表示與對照組相比較，P<0.05，** 表示與對照組相比較，P<0.01，#表示與高濃度染毒組相比較，P<0.05，##表示與高濃度染毒組相比較，P<0.01。（D）PAS 染色測定小鼠肝臟糖原含量。1.2 As2O3對小鼠肝臟糖代謝基因水平的影響以及牛磺酸的保護作用我們對小鼠肝臟組織中糖酵解基因和糖異生基因進行了檢測。RT-PCR 結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，高濃度染毒組小鼠肝臟糖酵解基因： L-PK 和 GK 的表達水平顯著降低。給予�；撬犷A(yù)處理后，與高濃度染毒組相比，各基因表達水平均

20圖 2As2O3對小鼠肝臟糖代謝基因水平的影響以及�；撬岬谋Ｗo作用 mg/kg As2O3處理C57BL/6J小鼠12周，�；撬岜Ｗo組小鼠在4 mg/kg As2O3染毒基礎(chǔ)上每天用25進行灌胃。（A）RT-PCR 檢測糖酵解基因 GK 和 L-PK 表達水平。（B）RT-PCR 檢測糖異生基因 G6e、FOXO1、PEPCK 和 PGC-1 表達水平。n=3，條圖以均值±標準差來表示，* 表示與對照組相，** 表示與對照組相比較，P<0.01，##表示與高濃度染毒組相比較，P<0.01。 As2O3對小鼠肝臟糖代謝蛋白水平的影響以及�；撬嵊肳estern blot 結(jié)果顯示，GLUT2 蛋白的表達隨 As2O3染毒劑量的增加而T2 是肝臟進行葡萄糖轉(zhuǎn)運的重要載體，其表達下降提示 As2O3暴露降低萄糖轉(zhuǎn)運能力。p-GSK3β 隨 As2O3染毒劑量的增加而增加,提示糖原合成

圖 3As2O3對小鼠肝臟糖代謝蛋白水平的影響以及�；撬岬谋Ｗo作用1~4 mg/kg As2O3處理 C57BL/6J 小鼠 12 周，�；撬岜Ｗo組小鼠在 4 mg/kg As2O3染毒基礎(chǔ)上每天用 250mg/kg �；撬徇M行灌胃。（A）Western blot 檢測 GLUT2、GSK3β、p-GSK3β 蛋白表達，以 β-actin 作為內(nèi)參。（B）GLUT2 蛋白的顯影密度分析，GLUT2 相對表達水平以占 β-actin 的百分比來表示。（C）p-GSK3β 蛋白的顯影密度分析，p-GSK3β 相對表達水平以占 GSK3β 的百分比來表示。n=3，條圖以均值±標準差來表示，* 表示與對照組相比較，P<0.05，** 表示與對照組相比較，P<0.01，#表示與高濃度染毒組相比較，P<0.05，##表示與高濃度染毒組相比較，P<0.01。1.4 As2O3對小鼠肝臟 PPARγ 和 p-Akt 蛋白表達的影響以及�；撬岬谋Ｗo作用PPARγ 和 mTORC2 對調(diào)控肝臟糖脂代謝起著重要作用。給予 1~4 mg/kgAs2O3處理后，PPARγ 和 mTORC2 的靶蛋白 p-Akt 蛋白表達與對照組相比均顯著下降。與高濃度染毒組相比，�；撬岜Ｗo組中 PPARγ 和 p-Akt 蛋白表達水平均有所增加（如圖 4A-C 所示）。組織免疫熒光進一步驗證肝組織 p-Akt 的表達，其結(jié)果與

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本文編號：2771410