【摘要】：目的橋本甲狀腺炎(橋本),又稱慢性淋巴性甲狀腺炎,是臨床上甲狀腺功能減退的最常見病因�，F(xiàn)普遍認為甲狀腺功能減退會影響患者的情緒表現(xiàn)。然而,近年來多項臨床研究報告指出,即使甲狀腺功能正常時,橋本也與情緒行為異常有關,尤其是抑郁和焦慮,但其機制不清。臨床研究和動物實驗證實神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥與情緒障礙性疾病發(fā)生發(fā)展有關,在其中起著重要作用。因此,本研究擬建立甲狀腺功能正常的橋本動物模型,并在此基礎上觀察橋本本身對小鼠焦慮和抑郁樣行為的影響,同時觀察額葉內(nèi)相關的神經(jīng)炎癥事件,如小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活以及相關炎性因子的產(chǎn)生等,旨在探討甲狀腺功能正常狀態(tài)下橋本對情緒行為的影響及相關的神經(jīng)炎性機制。方法雌性NOD小鼠20只,適應喂養(yǎng)7天后隨機分為兩組,即對照組和橋本組。通過甲狀腺球蛋白聯(lián)合佐劑兩次尾部皮下免疫小鼠構建橋本動物模型。正常小鼠在相同的時間點單獨佐劑皮下免疫作為對照組。第二次免疫4周后,利用曠場實驗以及高架十字迷宮檢測兩組小鼠的焦慮樣行為,強迫游泳和懸尾測試檢測抑郁樣行為。行為學檢測結束隔天,下腔靜脈采血,冰上取甲狀腺和腦組織,分離出額葉。采用電化學發(fā)光免疫法和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測各組小鼠血清中甲狀腺炎相關參數(shù)水平。HE染色評估各組小鼠甲狀腺病理。免疫組織化學法觀察額葉內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞形態(tài)。透射電鏡觀察額葉內(nèi)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元超微結構。實時RT-PCR檢測額葉膠質(zhì)細胞標記物(Iba1和GFAP)以及膠質(zhì)源性炎癥因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)的表達。TUNEL染色評估神經(jīng)元凋亡。最后,利用實時RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附法評估額葉內(nèi)與炎癥密切相關的5-羥色胺(5-HT)信號傳導情況。結果1.甲狀腺功能正常橋本模型建立:(1)體重情況:實驗過程中對照和橋本兩組小鼠的體重和體重增長速率沒有差異。(2)甲狀腺病理:對照組小鼠甲狀腺濾泡完整,排列整齊,基本不可見單核細胞的浸潤。而橋本小鼠甲狀腺內(nèi)可見明顯的單核細胞浸潤,而且伴有明顯的甲狀腺腫大,甲狀腺濾泡的破壞,排列紊亂。進一步病理分級顯示,與對照組小鼠比較,橋本小鼠甲狀腺內(nèi)單核細胞浸潤程度明顯加重(P0.001)。(3)甲狀腺炎相關參數(shù)血清水平:與對照組比較,橋本小鼠的血清Tg-Ab(P0.001)和TPO-Ab(P0.01)水平均顯著升高,而兩組小鼠的T3,T4和TSH血清水平無統(tǒng)計學差異。2.行為學結果:(1)曠場實驗:與對照小鼠相比,橋本小鼠中央?yún)^(qū)進入次數(shù)降低(P0.05),中央?yún)^(qū)停留時間也明顯縮短(P0.001);自主運動方面,兩組小鼠總距離和平均速度沒有統(tǒng)計學差異;直立次數(shù)方面,橋本小鼠較對照組明顯降低(P0.05);修飾次數(shù)方面,橋本小鼠也較對照組降低(P0.05)。(2)高架十字迷宮:與對照小鼠相比,橋本小鼠開臂的總停留時間(P0.05)以及進入次數(shù)(P0.05)均顯著降低。與此一致地,橋本小鼠開臂停留時間占比(%)(P0.01)及其進入開臂次數(shù)所占百分比(P0.05)亦較對照組相比明顯降低。(3)強迫游泳:與對照組小鼠相比,橋本小鼠的不動時間明顯延長,具有統(tǒng)計學差異(P0.01)。(4)懸尾實驗:橋本小鼠的不動時間較對照組相比明顯延長(P0.001)。3.小膠質(zhì)細胞活化評價:(1)Iba1組織化學染色:與對照小鼠相比,橋本小鼠額葉內(nèi)激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)目和Iba1陽性染色面積占比均顯著升高(P0.05,P0.05);(2)RT-PCR:橋本小鼠額葉Iba1 m RNA表達較對照組顯著升高(P0.01)。(3)透射電鏡:對照組額葉小膠質(zhì)細胞核形態(tài)不規(guī)則,核內(nèi)染色質(zhì)邊集,胞漿內(nèi)細胞器稀少,偶見個別溶酶體。相比而言,橋本小鼠額葉內(nèi)小膠質(zhì)細胞核變大,核染色質(zhì)邊集明顯,胞漿內(nèi)溶酶體數(shù)量增加,出現(xiàn)了激活的溶酶體—次級溶酶體。4.星形膠質(zhì)細胞活化評價:(1)GFAP組織化學染色:與對照小鼠相比,橋本小鼠額葉星形膠質(zhì)細胞胞體變大,染色加深,統(tǒng)計分析顯示激活的細胞數(shù)目和GFAP陽性染色面積占比均顯著升高(P0.001,P0.01);(2)RT-PCR:橋本小鼠額葉GFAP m RNA水平較對照組顯著升高(P0.05)。(3)透射電鏡:對照組小鼠額葉星形膠質(zhì)細胞核內(nèi)染色質(zhì)呈典型的環(huán)狀邊集,胞漿內(nèi)細胞器較少,含有少量線粒體,核糖體,和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。相比而言,橋本小鼠額葉內(nèi),星形膠質(zhì)細胞核變大,胞漿內(nèi)細胞器明顯增加,含有功能活躍的高爾基體、大量的線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。5.炎癥因子表達:與對照組小鼠相比,橋本小鼠額葉內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-αm RNA水平顯著上調(diào)(P0.05,P0.05),IL-6 m RNA水平有升高趨勢(P=0.08)。6.神經(jīng)元超微結構;對照組小鼠額葉神經(jīng)元核膜光滑完整,核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。胞漿內(nèi)細胞器豐富,含有大量的核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等成分。橋本小鼠神經(jīng)元超微結構特征與對照組相似,未見明顯的超微結構損傷。7.神經(jīng)元凋亡:(1)透射電鏡:對照和橋本小鼠額葉內(nèi)神經(jīng)元均未見染色質(zhì)聚集、核固縮、凋亡小體等典型神經(jīng)元凋亡特征。(2)TNNEL染色:兩組小鼠額葉內(nèi)TUNEL陽性染色神經(jīng)元無明顯差異。8.5-HT信號通路變化:橋本小鼠色氨酸(合成5-HT原料)降解酶吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO1)和5-HT轉運蛋白(serotonin transporter,SERT)的m RNA表達均顯著高于對照組小鼠(P0.05,P0.01)。另外,與對照組相比,橋本小鼠額葉的5-HT濃度明顯降低(P0.05)。結論甲狀腺功能正常狀態(tài)下,橋本甲狀腺炎誘發(fā)小鼠額葉內(nèi)神經(jīng)炎癥反應,影響與炎癥密切相關的5-HT信號通路,提示神經(jīng)炎癥可能參與橋本甲狀腺炎情緒異常的神經(jīng)調(diào)控。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R581.4
【圖文】：

實驗設計流程圖

圖 2 對照組у HT 組小鼠甲狀腺的病理學變化情況HE 染色評估對照組у HT 組小鼠甲狀腺病理情況。（A）對照組у HT 組小鼠甲狀腺 HE 染色的代表性圖片，5× 物鏡視野；（B）對照組у HT 組小鼠甲狀腺炎評分結果，評分標準在方法部分中闡述。數(shù)據(jù)資料以均值±標準誤表示，n = 10。у對照組比較，***P < 0.001。Fig 2 The pathological changes of thyroids in Con and HT groupThe HE staining was used to evaluate the pathological changes of thyroids in animals. (A)Representative thyroid sections stained with HE shown at magnification 5×. (B) Quantitation of thedegree of monocyte infiltration in thyroids. The analysis was done as described in the Methods. Datawere presented as the mean ±SEM (n = 10);***P < 0.001, vs. Con.3.1.3 兩組小鼠血清甲狀腺炎相關參數(shù)水平

-Ab (IU/m) 24.93±1.12 30.15±1.4 (nmol/l) 1.48±0.10 1.63±0.1 (nmol/l) 39.37±2.53 39.16±3.6H (pg/ml) 341.36±34.00 351.14±37以均值±標準誤表示。у對照組比較，**P < 0.01,***P < 0.001。 presented as the mean ±SEM;**P < 0.01, and***P < 0.001, vs. Con.小鼠額葉 Tg-Ab 和 TPO-Ab 水平究中，我們進 步采用 ELICA 法檢測了對照組和 HT 組小鼠額 Tg-Ab 和 TPO-Ab 濃度，并根據(jù) BCA 所測的額葉總蛋白濃度進示，у對照組小鼠比較，HT 組小鼠額葉т清液 Tg-Ab 水平明顯PO-Ab 水平有т升趨勢（P = 0.09）。

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本文編號：2769705