【摘要】：目的:探究中性粒細胞胞外網(wǎng)狀陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)對類風濕關(guān)節(jié)炎患者主要的效應細胞滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)和滑膜巨噬細胞的作用機制。方法:取RA患者滑膜組織分離培養(yǎng)滑膜成纖維細胞,進行免疫熒光染色鑒定;通過小鼠腹腔刺激實驗獲取并培養(yǎng)巨噬細胞;提取健康人外周血中性粒細胞,刺激NETs形成并提取NETs;用Cell Titer 96?AQueous單溶液試劑(MTS)增殖實驗評估NETs對RA-FLSs增殖;NETs刺激RA-FLSs60h后,分別收集細胞上清液和細胞,ELISA檢測細胞上清液中白細胞介素6(interlukin-6,IL-6)和白細胞介素25(interlukin-25,IL-25)的水平;收集的RA-FLSs提取總RNA,用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(q RT-PCR)測定RA-FLSs中結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)m RNA的表達情況,收集RA-FLSs提取總蛋白,用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(western blot,WB)檢測哺乳動物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)表達變化;將NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液加入巨噬細胞培養(yǎng)7d,瑞吉染色觀察細胞形態(tài)變化。采用配對樣本t檢驗和單因素方差分析對結(jié)果進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果:1)分離純化的中性粒細胞體外刺激可形成NETs,提取的NETs測定DNA濃度為58.5ng/ul(1×106細胞);2)與對照組(0ul NETs)相比,NETs能促進RA-FLSs增殖,且隨著NETs濃度增加其促進RA-FLSs增殖的能力也增強(F=99.519,P0.001);3)與對照組(0ul NETs)相比,10ul NETs可以明顯促進RA-FLSs增殖(t=-12.226,P0.01);4)用DNaseⅠ預處理NETs后,其促進RA-FLSs增殖的作用受到抑制(t=-2.376,P=0.049);5)NETs能刺激RA-FLSs內(nèi)CTGF m RNA表達上調(diào)(30.696±0.468,t=12.13,P0.01);6)與對照組相比,NETs能刺激RA-FLSs內(nèi)MST1激酶表達顯著下調(diào)(P0.01);7)NETs刺激RA-FLSs60h后細胞上清液中IL-6和IL-25濃度高于對照組(P0.05);8)NETs刺激RA-FLSs60h后收集的上清液加入巨噬細胞培養(yǎng)7d后,巨噬細胞有一部分分化成了多核巨細胞,而用RA-FLSs上清液培養(yǎng)滑膜巨噬細胞7d后未發(fā)現(xiàn)有多核巨細胞生成。結(jié)論:NETs在體外能促進RA-FLSs增殖并刺激RA-FLSs內(nèi)MST1激酶表達顯著下調(diào),CTGF m RNA表達上調(diào),細胞上清液中IL-6、IL-25濃度高于對照組,提示NETs可能通過調(diào)控MST1激酶介導RA-FLSs增殖、產(chǎn)生CTGF及釋放多種炎性細胞因子。NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液能誘導巨噬細胞分化成多核巨細胞。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R593.22
【圖文】：

圖1：熒光染色鑒定NETs形成激中性粒細胞形成NETs，PicoGreen熒光染色可見細胞外纖維網(wǎng)狀Ts濃度測定粒細胞分離純化后體外刺激形成NETs，提取的NETs測定D（1 106細胞）。-FLSs鑒定疫熒光技術(shù)鑒定，綠色顯示是滑膜成纖維細胞的胞漿部分，維細胞的細胞核。細胞純度＞99%。

圖1：熒光染色鑒定NETs形成PMA刺激中性粒細胞形成NETs，PicoGreen熒光染色可見細胞外纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，箭頭標識為NETs3.1.2 NETs濃度測定中性粒細胞分離純化后體外刺激形成NETs，提取的NETs測定DNA濃度58.5ng/ul（1 106細胞）。3.1.3 RA-FLSs鑒定經(jīng)免疫熒光技術(shù)鑒定，綠色顯示是滑膜成纖維細胞的胞漿部分，藍色圓點是滑膜成纖維細胞的細胞核。細胞純度＞99%。

圖3：NETs刺激RA-FLSs增殖A：與對照組（0ul NETs）相比，NETs能促進RA-FLSs增殖，且隨著NETs濃A-FLSs增殖的能力也增強（F=99.519,P<0.01）；圖3B：與對照組（0ul NETs）Ts可以明顯促進RA-FLSs增殖（t=-12.226，P<0.01）；用DNaseⅠ預處理NET-FLSs增殖的作用受到抑制（t=-2.376，P=0.049）。NETs刺激RA-FLSs的上清液培養(yǎng)巨噬細胞NETs刺激RA-FLSs60h后的上清液去培養(yǎng)滑膜巨噬細胞7d，實驗組巨部分分化成了多核巨細胞，很可能就是分化成了破骨細胞，而對照組巨細胞。

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本文編號：2763711