【摘要】：目的:探究中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)狀陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者主要的效應(yīng)細(xì)胞滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)和滑膜巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制。方法:取RA患者滑膜組織分離培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞,進(jìn)行免疫熒光染色鑒定;通過小鼠腹腔刺激實(shí)驗(yàn)獲取并培養(yǎng)巨噬細(xì)胞;提取健康人外周血中性粒細(xì)胞,刺激NETs形成并提取NETs;用Cell Titer 96?AQueous單溶液試劑(MTS)增殖實(shí)驗(yàn)評估NETs對RA-FLSs增殖;NETs刺激RA-FLSs60h后,分別收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞,ELISA檢測細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素6(interlukin-6,IL-6)和白細(xì)胞介素25(interlukin-25,IL-25)的水平;收集的RA-FLSs提取總RNA,用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q RT-PCR)測定RA-FLSs中結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)m RNA的表達(dá)情況,收集RA-FLSs提取總蛋白,用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot,WB)檢測哺乳動物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)表達(dá)變化;將NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)7d,瑞吉染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化。采用配對樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果:1)分離純化的中性粒細(xì)胞體外刺激可形成NETs,提取的NETs測定DNA濃度為58.5ng/ul(1×106細(xì)胞);2)與對照組(0ul NETs)相比,NETs能促進(jìn)RA-FLSs增殖,且隨著NETs濃度增加其促進(jìn)RA-FLSs增殖的能力也增強(qiáng)(F=99.519,P0.001);3)與對照組(0ul NETs)相比,10ul NETs可以明顯促進(jìn)RA-FLSs增殖(t=-12.226,P0.01);4)用DNaseⅠ預(yù)處理NETs后,其促進(jìn)RA-FLSs增殖的作用受到抑制(t=-2.376,P=0.049);5)NETs能刺激RA-FLSs內(nèi)CTGF m RNA表達(dá)上調(diào)(30.696±0.468,t=12.13,P0.01);6)與對照組相比,NETs能刺激RA-FLSs內(nèi)MST1激酶表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01);7)NETs刺激RA-FLSs60h后細(xì)胞上清液中IL-6和IL-25濃度高于對照組(P0.05);8)NETs刺激RA-FLSs60h后收集的上清液加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)7d后,巨噬細(xì)胞有一部分分化成了多核巨細(xì)胞,而用RA-FLSs上清液培養(yǎng)滑膜巨噬細(xì)胞7d后未發(fā)現(xiàn)有多核巨細(xì)胞生成。結(jié)論:NETs在體外能促進(jìn)RA-FLSs增殖并刺激RA-FLSs內(nèi)MST1激酶表達(dá)顯著下調(diào),CTGF m RNA表達(dá)上調(diào),細(xì)胞上清液中IL-6、IL-25濃度高于對照組,提示NETs可能通過調(diào)控MST1激酶介導(dǎo)RA-FLSs增殖、產(chǎn)生CTGF及釋放多種炎性細(xì)胞因子。NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化成多核巨細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R593.22
【圖文】：

圖1：熒光染色鑒定NETs形成激中性粒細(xì)胞形成NETs，PicoGreen熒光染色可見細(xì)胞外纖維網(wǎng)狀Ts濃度測定粒細(xì)胞分離純化后體外刺激形成NETs，提取的NETs測定D（1 106細(xì)胞）。-FLSs鑒定疫熒光技術(shù)鑒定，綠色顯示是滑膜成纖維細(xì)胞的胞漿部分，維細(xì)胞的細(xì)胞核。細(xì)胞純度＞99%。

圖1：熒光染色鑒定NETs形成PMA刺激中性粒細(xì)胞形成NETs，PicoGreen熒光染色可見細(xì)胞外纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，箭頭標(biāo)識為NETs3.1.2 NETs濃度測定中性粒細(xì)胞分離純化后體外刺激形成NETs，提取的NETs測定DNA濃度58.5ng/ul（1 106細(xì)胞）。3.1.3 RA-FLSs鑒定經(jīng)免疫熒光技術(shù)鑒定，綠色顯示是滑膜成纖維細(xì)胞的胞漿部分，藍(lán)色圓點(diǎn)是滑膜成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核。細(xì)胞純度＞99%。

圖3：NETs刺激RA-FLSs增殖A：與對照組（0ul NETs）相比，NETs能促進(jìn)RA-FLSs增殖，且隨著NETs濃A-FLSs增殖的能力也增強(qiáng)（F=99.519,P<0.01）；圖3B：與對照組（0ul NETs）Ts可以明顯促進(jìn)RA-FLSs增殖（t=-12.226，P<0.01）；用DNaseⅠ預(yù)處理NET-FLSs增殖的作用受到抑制（t=-2.376，P=0.049）。NETs刺激RA-FLSs的上清液培養(yǎng)巨噬細(xì)胞NETs刺激RA-FLSs60h后的上清液去培養(yǎng)滑膜巨噬細(xì)胞7d，實(shí)驗(yàn)組巨部分分化成了多核巨細(xì)胞，很可能就是分化成了破骨細(xì)胞，而對照組巨細(xì)胞。

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本文編號：2763711