【摘要】：目的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是主要針對多種關(guān)節(jié)的慢性和系統(tǒng)性自身免疫性疾病,具有行為學(xué)未知,進行性殘疾,全身性并發(fā)癥,早期高死亡率和高社會經(jīng)濟成本等特點。在這個疾病中,免疫系統(tǒng)的紊亂可能會導(dǎo)致慢性滑膜炎及血管翳形成,并接連造成滑膜、軟骨和骨的損傷,以至于造成關(guān)節(jié)畸形和功能喪失,在這一過程中受刺激的免疫細胞產(chǎn)生了大量的細胞因子,其中的一部分可以誘發(fā)滑膜炎癥,有的則可以通過對信號通路的激活促進金屬基質(zhì)蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的分泌,造成關(guān)節(jié)骨和軟骨不可逆的損傷。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了眾多治療這種異質(zhì)性疾病的藥物,但仍有約30%患者的疾病不能得到很好控制。miRNA(microRNA)是存在于細胞內(nèi)的一類單鏈小分子RNA,已有很多報道顯示,miRNA表達水平的失調(diào)是造成RA患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)信號傳導(dǎo)通路和細胞因子表達水平紊亂的重要原因之一,在RA的發(fā)生發(fā)展進程中起到重要的作用。因此,在這個課題中,我們把miR-145-5p作為研究對象,旨在通過研究RA中miR-145-5p對IL-17的調(diào)控作用,進一步了解RA的發(fā)病機制,從而為RA的診斷、個性化治療以及預(yù)后的判斷提供重要線索和新的治療靶點。方法本實驗在RA-CD4+T細胞和成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synovial cells,FLS)兩個細胞系中進行研究。檢測RA-CD4+T細胞與T細胞其他亞群中miR-145-5p的表達量;在RA-CD4+T細胞中過表達miR-145-5p,根據(jù)實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)的結(jié)果確定轉(zhuǎn)染效果;流式細胞儀檢測過表達miR-145-5p后Th-17細胞的分化情況;Q-PCR檢測過表達miR-145-5p后IL-17表達水平。在RA-FLS中,先在過表達miR-145-5p成功的前提下加入NF-κB,P53/MDM2,JNK及MAPK四條通路相應(yīng)的通路抑制劑BAY11-7082,Nutlin-3,SP600125及SB203580,選取能夠明顯抑制MMPs表達的通路進一步探究;通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)評估信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子蛋白表達量的變化;免疫熒光分析檢測相應(yīng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的核定位及活化情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定 RA-FLS 培養(yǎng)基加入 IL-17 刺激后 MMPs 表達情況。結(jié)果1.RA-CD4+T細胞中miR-145-5p的表達水平高于T細胞其他亞群。2.RA-CD4+T細胞過表miR-145-5p后流式檢測結(jié)果表明Th-17細胞分化比例增加,IL-17表達增多。3.四條通路分析中,只有加入核因子κB(NF-κB)信號傳導(dǎo)通路的化學(xué)抑制劑BAY11-7082后顯著減弱了 MMP-9的表達水平,未見其他通路的抑制劑對MMPs的表達有顯著影響。4.過表達miR-145-5p后p-P65的水平顯著增加,而IκB-α的水平顯著降低,相反miR-145-5p的減少導(dǎo)致p-P65水平的顯著下調(diào),同時增加IκB-α的水平。5.對NF-κB通路進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-145-5p的過表達促進了可作為NF-κB通路活化標志物的P65由胞質(zhì)入核。6.RA-FLS培養(yǎng)基中加入IL-17刺激細胞后,RA-FLS分泌MMP-9增多。結(jié)論MiR-145-5p過表達顯著增加了 RA-CD4+T細胞中Th-17細胞的分化,增加了 IL-17的表達水平。同時RA-FLS中高表達的miR-145-5p可以通過激活NF-κB 通路促進 MMP-9 的表達,IL-17 也可以通過旁分泌的方式作用于 RA-FLS細胞,進一步促進MMP-9的表達從而加重關(guān)節(jié)骨與軟骨的破壞,加速骨質(zhì)侵蝕的過程,增加疾病的嚴重程度。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R593.22
【圖文】：

在內(nèi)的多種免疫細胞與白介素，ＴＮＦ－ａ等多種細胞因子參與病理過程的不同階逡逑段，免疫細胞及炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致滑膜炎，滑膜和軟骨的增殖以及軟骨逡逑下膏的破壞＜？邋（圖１．摘＿自參考文獻２邋）逡逑ＧｆｎＨｋ邐ＣｉｔｒａＵｉｎａｌｉｏｎ邋ＥｎｖｉｒｏｏｍｆｉＭＩ逡逑ｐｉｒｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏａ邐0ｒｐｒｏｌｒｉｎｓ邐ｆａｒｔｏｒｓ逡逑［＾念Ｓ．：Q\0逡逑Ｊ邋Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ邐ｐｉ＾ｍａ邋ｃｃＵ邐、＼邐Ａ逡逑＾。逡逑Ｈ邐’邐Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ邋／邋’ＮｅｕｔｒｏｐｈＵ逡逑Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｉｍｎｉｍｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｔｏ邋ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ邋ａｎｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邐Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｐｈａｓｅ邋ｏｆ邋ａｕｔｏｉｎｍｕｍｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ逡逑圖１邋ＲＡ發(fā)病機制圖逡逑１．２臨床癥狀和病理特征逡逑作為一種常見的自身免疫病，ＲＡ具有典型的臨床表現(xiàn)與病理特征。逡逑１逡逑

通過靶向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中信號通路及免疫分子的表達，在ＲＡ的發(fā)生發(fā)展進程妒逡逑起到十分重要的作用［５９］。逡逑１．６．２不同ｍｉｃｒｏＲＮＡ與ＲＡ的關(guān)系（圖２．摘自參考文獻６０）：逡逑Ｐｒｏ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ逡逑ｉｍｉＲ－１４６ａ逡逑ｉｍｉＲ－３６３邋＾邋ｖ邋）邐＾邋ｉｍｉＲ－２１逡逑ｔｍｉＲ－３４ａ邐＾逡逑Ｙ邋ｉ邐ｔｍｉＲ－１５５逡逑？卜蠢—松逡逑Ｓｅｌｆａｎｔｌｇｅｎｓ邋＊１１１：＾？邋／ｎＨＴ邋＼逡逑＼邐＼邐個邋Ｐｌａｓｍａ邋ｃｅｌｌｓ逡逑＾邋＿邋ｙ＾ＡＮＫＬ邋｜Ｌ－１７Ｖ邐＾逡逑ｔｍｉＲ－３３邐ＩＬ＇２１邐＼邐丫邋ｆ邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑—１Ｌ－２２＼逡逑ｖ邐ＲＡＮＫＬ＞＾邐ｔｍｉＲ－１４３逡逑Ｍｏｎｏｃｙｔｅ／邐ｔｍｉＲ－１４５逡逑Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ邐邋？邐個邋ｍｉＲ－２０３逡逑＼邐（邋Ｓｙｎｏｖｉａｌ邋Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ邋＾ｎｆｉｉＲ－１０ａ逡逑＼邐，Ｌ＇６邋！邋Ｉ邐ｉｍｉＲ－１７逡逑＼邋ＩＬ部個逡逑＼邐ｔ邋ＭＭＰｓ逡逑Ｘ邐Ｃａｒｔｉｌａｇｅ逡逑個邋Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ逡逑Ｂｏｎｅ逡逑圖２邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ調(diào)控ＲＡ機制圖逡逑１）邐ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１６逡逑ＲＡ患者與健康對照組或疾病對照組相比，滑液，血漿和外周血單個核細逡逑胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邋ｂｌｏｏｄ邋ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ邋ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ．）：中的邋ｍｉＲ－１６邋水平升高＾邋并，灄■與．逡逑疾病的活動性相關(guān)［６１６２］。在Ｆｉｌｋｏｖａ等人的一項研究中，報道稱早期ＲＡ患者逡逑血清中的ｍｉＲ－１６低于已．靡ＲＡ多年的哢者和健康對．照．（Ｈｅａｌｔｈｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文－５ｐ在ＲＡ－ＣＤ４＋Ｔ細胞中的調(diào)控研究逡逑ＣＤ４＋Ｔ細胞中白勺ｍｉＲ－１４５－５ｐ白勺表達７ｊ＜平高于其他Ｔｒｉｚｏｌ處理后凍存的ＲＡ－ＣＤ４＋Ｔ細胞裂解后的樣本本，提取ＲＮＡ并反轉(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ后經(jīng)過Ｑ－ＰＣＲ測平，Ｕ６做為內(nèi)部參照，結(jié)果顯示ＲＡ患者ＣＤ４＋Ｔ量顯著高于其他Ｔ細胞亞群。這說明ｍｉＲ－１４５－５ｐ見圖Ｕ逡逑１５－１邐＊逡逑

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