【摘要】：研究背景:慢性氟中毒是一種地方性疾病,主要病因是攝入過量氟導(dǎo)致以骨骼病變?yōu)橹鞯牡胤叫约膊?迄今為止發(fā)病機(jī)制并不清楚。氟中毒的骨骼改變(氟骨癥)包括骨硬化,骨軟化,骨質(zhì)疏松和骨周軟組織鈣(骨)化,其中骨周軟組織鈣(骨)化屬于異位鈣化、異位骨化的范疇,主要見于骨周軟組織,其主要細(xì)胞成分是成纖維細(xì)胞(fibrobalst,FB)。Cbfa1是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,是成骨細(xì)胞分化以及成骨的必要條件。本課題組過去的研究中發(fā)現(xiàn),氟化物可以明顯增強(qiáng)FB中Cbfa1從mRNA到蛋白的表達(dá),證實(shí)FB在氟化物的作用下已經(jīng)具備了成骨的條件。研究還發(fā)現(xiàn),染氟成纖維細(xì)胞中骨代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的其他成骨相關(guān)因子的表達(dá)也明顯增強(qiáng),提示這些成骨因子亦在FB成骨過程中舉足輕重。本研究以體外實(shí)驗(yàn)的方法,進(jìn)一步確認(rèn)在不同的染氟條件下FB中各種因素的改變,同時尋找各種骨生長因子在染氟FB中的相互關(guān)系,試圖發(fā)現(xiàn)其中是否存在一個或幾個重要的始發(fā)因素,從而促動或聯(lián)合其他因子共同刺激FB的成骨過程,以期為氟骨癥骨周軟組織骨(鈣)化的發(fā)病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:本實(shí)驗(yàn)以小鼠成纖維細(xì)胞株L929作為研究對象。將FB分為兩個染氟劑量組(劑量組一:對照組、0.0001、0.001、0.1、1 mg/L F~-組;劑量組二:對照組、2、5、10 mg/L F~-組)。采用的實(shí)驗(yàn)方法包括:CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性;Gomori鈣鈷法檢測FB堿性磷酸酶活性;實(shí)時定量PCR和Western-Blot檢測細(xì)胞Cbfa1、BMP-2、OCN、TGF-β、IGF-1、FGF-2、PDGF-B、PTH、PTH-rp、CT和CaSR mRNA、蛋白表達(dá)水平。同時重點(diǎn)對檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:1.CCK-8結(jié)果顯示,與對照組相比,2 mg/L F-、5 mg/L F-可刺激細(xì)胞活性,10 mg/L F-則抑制細(xì)胞活性,且隨著染氟時間延長,細(xì)胞的增殖活性下降;2.與對照組相比,2 mg/L F-組和5 mg/L F-組ALP活性明顯增強(qiáng),而10 mg/L F-組ALP活性低于對照組;3.實(shí)時定量PCR以及Western Blot結(jié)果:(1)染氟FB Cbfa1、BMP-2和OCN m RNA和蛋白水平均有提高;(2)染氟FB TGF-βm RNA除染氟10 mg/L組表達(dá)增強(qiáng)以外,其余各組變化不明顯甚至明顯降低,但其蛋白表達(dá)水平在各染氟濃度下均明顯上調(diào);(3)染氟明顯上調(diào)FB IGF-1 m RNA和蛋白的表達(dá);(4)染氟0.1 mg/L組和10 mg/L組PDGF-B m RNA表達(dá)明顯增強(qiáng),1 mg/L和2 mg/L組PDGF-B蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng);(5)除染氟0.001 mg/L組外,其余加氟組FGF-2 m RNA表達(dá)均增強(qiáng)或明顯增強(qiáng);染氟2 mg/L和5 mg/L組FGF-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng);(6)本實(shí)驗(yàn)中PTH m RNA和蛋白在多數(shù)染氟組均表達(dá)增強(qiáng),PTH-rp m RNA在較低劑量組表達(dá)明顯增強(qiáng),較高劑量組表達(dá)明顯減弱,而PTH-rp蛋白的表達(dá)則與m RNA剛好相反;(7)氟對CT和Ca SR m RNA和蛋白的表達(dá)呈普遍增強(qiáng)趨勢;4.因素相關(guān)分析結(jié)果:(1)Cbfa1、BMP-2、OCN、TGF-β(1)染氟1 mg/L組,Cbfa1蛋白和BMP-2蛋白的表達(dá)增加呈顯著正相關(guān);(2)染氟5 mg/L組,Cbfa1和OCN在FB中的蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān);(3)染氟10 mg/L組Cbfa1和OCN蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系;(4)BMP-2和OCN之間僅在1 mg/L組蛋白表達(dá)存在負(fù)相關(guān);(5)TGF-β和Cbfa1、BMP-2、OCN之間關(guān)系規(guī)律不明顯。(2)IGF-1、FGF-2和PDGF-B(1)IGF-1和PDGF-B蛋白表達(dá)在染氟5 mg/L、10 mg/L組呈明顯正相關(guān);(2)IGF-1、FGF-2 m RNA表達(dá)在染氟2 mg/L組明顯正相關(guān),但在0.001 mg/L和10 mg/L組呈負(fù)相關(guān);(3)FGF-2和PDGF-B m RNA在0.0001 mg/L、0.1 mg/L和5 mg/L組為正相關(guān),蛋白在2 mg/L組正相關(guān),但在0.1 mg/L組負(fù)相關(guān);(4)TGF-β和PDGF-B m RNA表達(dá)在2 mg/L和5 mg/L組正相關(guān),蛋白在0.001 mg/L組正相關(guān),但在1 mg/L組負(fù)相關(guān)。(3)PTH、PTH-rp、CT和Cas R (1)PTH和Ca SR m RNA表達(dá)在0.1 mg/L和1 mg/L組正相關(guān),0.0001 mg/L和0.001 mg/L組負(fù)相關(guān);(2)PTH-rp和Ca SR m RNA在0.001 mg/L、10 mg/L組均為明顯正相關(guān),在0.0001 mg/L、0.1 mg/L組為負(fù)相關(guān),蛋白在0.0001 mg/L、0.001 mg/L、2 mg/L組為正相關(guān),5 mg/L組為負(fù)相關(guān);(3)PTH-rp和CT m RNA表達(dá)在0.001 mg/L組負(fù)相關(guān),蛋白在10 mg/L組正相關(guān),但在0.001 mg/L、0.1 mg/L組負(fù)相關(guān);(4)PTH和PTH-rp蛋白表達(dá)在10 mg/L組負(fù)相關(guān),m RNA表達(dá)在0.0001 mg/L組為正相關(guān),0.001 mg/L和0.1 mg/L組為負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1.氟化物明顯刺激FB增殖及成骨表型表達(dá)(1)氟化物明顯刺激FB的增殖、分化;(2)染氟FB中ALP表達(dá)明顯增強(qiáng);(3)染氟刺激FB Cbfa1、BMP-2和OCN從m RNA到蛋白的表達(dá)。2.染氟FB細(xì)胞骨生長因子IGF-1、FGF-2和PDGF-B的表達(dá)(1)染氟濃度影響FB中IGF-1 m RNA和蛋白的表達(dá),總的作用以明顯上調(diào)為主;(2)染氟明顯刺激FB中FGF-2和PDGF-B的表達(dá)。3.染氟FB PTH、PTH-rp、CT以及Ca SR的表達(dá)(1)FB染氟48 h,PTH m RNA和蛋白在多數(shù)染氟組以表達(dá)增強(qiáng)為主但PTH-rp m RNA在較低劑量組表達(dá)明顯增強(qiáng),較高劑量組明顯減弱;PTH-rp蛋白則剛好相反;(2)染氟對FB CT的作用以刺激增強(qiáng)為主;(3)染氟FB Ca SR m RNA和蛋白的表達(dá)以增強(qiáng)趨勢為主。4.Cbfa1與其他相關(guān)因素的相關(guān)性分析(1)Cbfa1與成骨蛋白、骨生長因子以及和成骨相關(guān)的諸多因素存在錯綜復(fù)雜的相互關(guān)系。這種相關(guān)性受染氟濃度的影響,而且在m RNA和蛋白表達(dá)方面反應(yīng)不同甚至作用相反;(2)成骨相關(guān)因素之間存在復(fù)雜、規(guī)律不明顯的相互關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R599.1
【圖文】：

圖 1 FB 生長曲線細(xì)胞增長趨勢來看，染氟早期，各組細(xì)胞的增殖活性均有 5 mg/L 組的細(xì)胞增殖活性顯著高于對照組，染氟 2 mg/輕微刺激細(xì)胞活性。隨著染氟時間延長，細(xì)胞的增殖活性 氟作用下細(xì)胞活性明顯受到抑制。同時發(fā)現(xiàn)，不同時間段濃度的影響趨勢基本相同。i 鈣鈷法檢測 FB 堿性磷酸酶活性

圖 1 FB 生長曲線從圖中細(xì)胞增長趨勢來看，染氟早期，各組細(xì)胞的增殖活性均有一定程度的提高且染氟 5 mg/L 組的細(xì)胞增殖活性顯著高于對照組，染氟 2 mg/L 和染氟 10mg/L 只是輕微刺激細(xì)胞活性。隨著染氟時間延長，細(xì)胞的增殖活性下降，并且在 10 mg/L 氟作用下細(xì)胞活性明顯受到抑制。同時發(fā)現(xiàn)，不同時間段細(xì)胞增殖受到不同染氟濃度的影響趨勢基本相同。3.2 Gomori 鈣鈷法檢測 FB 堿性磷酸酶活性

FBCbfa1mRNA表達(dá)

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本文編號：2757574