【摘要】：目的:探究klotho(克老素,KL)通過何種機(jī)制來改善地塞米松(dexamethason,DEX)對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的抑制作用。方法:首先采用倒置熒光顯微鏡觀察含Klotho基因(Ad-KL)重組腺病毒和含綠色熒光蛋白基因(Ad-GFP)的重組腺病毒在MC3T3-E1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率,并用Western blot檢測KL蛋白表達(dá)水平。CCK-8檢測各組細(xì)胞的存活率,流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分析NF-кB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)組跟各組間的關(guān)系;通過Western blot和qPCR對各組凋亡蛋白和NF-κκB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測;激光共聚焦檢測IκB蛋白表達(dá)情況及NF-кB p65核移位。結(jié)果:MC3T3-E1細(xì)胞成功被Ad-KL轉(zhuǎn)染,且KL蛋白可以在細(xì)胞中高效表達(dá)。通過CCK-8及Western blot發(fā)現(xiàn)DEX誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡且cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加,而KL預(yù)處理后凋亡細(xì)胞數(shù)量較前明顯減少且cleaved caspase-3蛋白表達(dá)下降。PDTC可使DEX誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)減少并減弱DEX誘導(dǎo)的caspase-3增加。KL能夠通過減少DEX誘導(dǎo)的IκB降解,NF-кB p65的核移位和p65的磷酸化來降低DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡并同時(shí)減少caspase-3的表達(dá)。結(jié)論:KL能通過抑制NF-κB途徑來改善DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡。除此之外,KL還有可能通過其他信號通路來改善DEX誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡,具體如何尚需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明,KL有可能是未來防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(GIOP)的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580
【圖文】：

d-KL 和 Ad-GFP 轉(zhuǎn)染 MC3T3-E1 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后 KL 蛋白表達(dá)水平情況（ransfection of MC3T3-E1 cells withAd-KLand Ad-GFP, and KL protein elevels post-transfection（×200）使用免疫熒光顯微鏡觀察分別用 Ad-GFP 和 Ad-KL 轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)和 48 小片，200×）;（B）通過蛋白印跡檢測 KL 蛋白與β-actin 的相對表達(dá)水平，升高。 數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，表示為平均值±SEM。 ** p<0.05 Cells transfected with Ad-GFP and Ad-KL for 24 h and 48 h were obsuorescence microscopy (All figures, are magnified 200×)；(B) The relativ

圖 2 MC3T3-E1 細(xì)胞的存活率在不同 DEX 濃度下的影響t of different concentrations of DEX on the cytotoxicity o 4 mmol·L-1DEX 預(yù)處理 MC3T3-E1 細(xì)胞 24 小時(shí)。使用 4 mmol / L DEX 處理顯著降低活細(xì)胞群數(shù)值是平均值±比，*p<0.05，**p<0.01 和***p<0.001。

圖 3 KL 對 DEX 誘導(dǎo)的 MC3T3-E1 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of KL on DEX-induced apoptosis in MC3T3-E1 cells（A）通過 Western blot 檢測 caspase-3 和 cleaved caspase-3 的蛋白表達(dá)水平及其蛋白表定量分析。（B）通過 RT-qPCR 檢測 caspase-3 mRNA 的表達(dá)水平。（C）用相應(yīng)分組處胞后，用 CCK-8 法測量 MC3T3-E1 細(xì)胞的存活率。數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM

【參考文獻(xiàn)】

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1 李福春;TRPV5/TRPV6對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及成骨細(xì)胞信號傳遞的影響[D];吉林大學(xué);2008年

本文編號：2756317