【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種全身性的骨代謝性疾病,其發(fā)病特點(diǎn)為骨量降低以及骨組織微結(jié)構(gòu)受損,在此基礎(chǔ)上骨脆性增高以及骨折的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。由破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收功能和由成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成功能間所搭建起來的平衡決定了骨的整體代謝。在骨吸收過程中,破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性發(fā)揮著主體作用。RANKL在誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成中起關(guān)鍵作用。而RANKL可通過JNK1促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。JNK1活化后,通過其下游元件c-Jun磷酸化促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子AP-1形成與活化,導(dǎo)致破骨細(xì)胞形成;而且,活化的JNK1可通過獨(dú)立于c-Jun磷酸化之外的機(jī)制調(diào)控破骨細(xì)胞形成。應(yīng)激條件下,JNK1可被激活,進(jìn)一步活化自噬。而自噬參與到破骨細(xì)胞的增殖、分化及骨吸收活性中;RANKL對自噬亦有上調(diào)作用。但目前破骨細(xì)胞形成中,JNK1介導(dǎo)的自噬未得到驗(yàn)證。既往研究表明,在饑餓等應(yīng)激條件下,JNK1活化后可導(dǎo)致Bcl-2磷酸化,從而使Beclin1從Bcl-2-Beclin1復(fù)合體中解離出來,誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬與生存。而Beclin1在破骨細(xì)胞形成中發(fā)揮著重要作用�；赗ANKL與JNK1之間的通路聯(lián)系,RANKL有可能通過JNK1促進(jìn)Bcl-2磷酸化,而導(dǎo)致Beclin1進(jìn)入自噬流。因此,在RANKL干預(yù)下的破骨細(xì)胞形成中,JNK1-Bcl-2-Beclin1-自噬信號通路可能為c-Jun磷酸化之外的又一調(diào)控機(jī)制,這一假設(shè)需被驗(yàn)證。因此,本研究的目的在于闡明RANKL-JNK1-Bcl-2-Beclin1-自噬通路在破骨細(xì)胞形成中的意義,以期在充實(shí)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞自噬機(jī)制的同時(shí),為骨質(zhì)疏松癥的治療提供更多可供參考的藥理性靶點(diǎn)。主要研究方法:用RAW264.7細(xì)胞系及小鼠原代骨髓源巨噬細(xì)胞(BMMs)作為破骨細(xì)胞前體(osteoclast precursors,OCPs),結(jié)合Western blotting、細(xì)胞病毒和siRNA轉(zhuǎn)染、GFP熒光檢測、電鏡檢測、熒光素酶報(bào)告基因活性檢測、TRAP染色、qRT-PCR、annexin V FITC/PI染色、Tunel染色、免疫共沉淀與免疫熒光共定位等細(xì)胞、分子生物學(xué)方法等,從體外對破骨細(xì)胞形成中RANKL-JNK1信號對自噬活性的調(diào)控作用及可能的機(jī)制做一探討。此外,加入IL-17A的研究,將JNK1信號介導(dǎo)的自噬引入到炎癥性骨代謝病的研究中去,進(jìn)一步豐富上述機(jī)制探討。主要研究結(jié)果:第一部分JNK1通過自噬-TRAF3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成1.在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成中,JNK1受抑導(dǎo)致的的OCPs自噬失活可通過自噬蛋白Beclin1得以恢復(fù)1)在JNK抑制劑參與下,受到阻滯的OCPs的LC3轉(zhuǎn)換隨著Beclin1的過表達(dá)得到恢復(fù);2)RANKL使OCPs中的p-JNK1水平上升,而JNK1沉默減弱LC3轉(zhuǎn)換;3)JNK抑制劑介導(dǎo)的LC3 punctation的縮減通過Beclin1過表達(dá)而恢復(fù);4)由JNK抑制劑所抑制的自噬溶酶體通過Beclin1的過表達(dá)得以恢復(fù)。2.Beclin1的過表達(dá)可部分緩解JNK1抑制所導(dǎo)致的破骨細(xì)胞形成抑制3.TRAF3沉默可逆轉(zhuǎn)JNK抑制劑導(dǎo)致的破骨細(xì)胞形成抑制1)Beclin1過表達(dá)可在JNK1受抑后,使OCPs中TRAF3的降解水平恢復(fù);2)利用siRNA將TRAF3沉默后,可以緩解JNK1抑制導(dǎo)致的破骨細(xì)胞形成的減少。4.在氯喹存在條件下,TRAF3降解不受RANKL的影響1)RANKL與氯喹聯(lián)合干預(yù)下,TRAF3蛋白水平與氯喹單一干預(yù)組無異;2)RANKL與氯喹聯(lián)合干預(yù)使得TRAF6和p-JNK1蛋白水平明顯上升。5.JNK1受抑可放緩TRAF3的降解并增強(qiáng)氯喹對TRAF3降解的抑制第二部分JNK1介導(dǎo)的自噬在破骨細(xì)胞形成過程中通過TRAF3降解發(fā)揮抗凋亡作用1.在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成中,Beclin1過表達(dá)與雷帕霉素均抑制OCPs的凋亡,但氯喹起促進(jìn)作用1)Beclin1過表達(dá)可導(dǎo)致OCPs中caspase-3和PARP切割體明顯降低;2)自噬激活劑雷帕霉素使OCPs中caspase-3和PARP切割體、凋亡細(xì)胞均明顯減少,而自噬抑制劑氯喹的加入則使結(jié)果完全相反。2.JNK1受抑后,OCPs自噬活性受抑的同時(shí)伴凋亡的反向變化1)JNK1的沉默在防止RANKL誘導(dǎo)的OCPs自噬的同時(shí),還可促進(jìn)細(xì)胞凋亡;2)Beclin1過表達(dá)可抑制JNK抑制劑干預(yù)下所上調(diào)的凋亡水平。3.TRAF3沉默抑制OCPs的凋亡TRAF3沉默后,caspase-3及PARP切割體水平和凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯下降。4.TRAF3沉默抑制氯喹所上調(diào)的OCPs凋亡TRAF3沉默后,在自噬抑制劑氯喹存在條件下,caspase-3及PARP切割片段和凋亡細(xì)胞均顯著減少。5.TRAF3沉默防止JNK1抑制后促進(jìn)的OCPs凋亡TRAF3沉默后,在SP600125存在條件下,caspase-3及PARP切割體水平明顯降低,凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少。第三部分JNK1調(diào)控的Bcl-2磷酸化介導(dǎo)OCPs的自噬活化1.RANKL介導(dǎo)的p-JNK1、p-Bcl-2與LC3II三者間存在關(guān)聯(lián)用RANKL誘導(dǎo)后,p-JNK1、p-Bcl-2與LC3II三者的水平在時(shí)間和濃度依賴上均具有相似的變化趨勢,統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈正相關(guān);2.JNK1受抑可逆轉(zhuǎn)由RANKL促進(jìn)的Bcl-2的磷酸化水平用RANKL干預(yù)后,p-Bcl-2水平升高;但JNK1下調(diào)后,p-Bcl-2重新下降。3.JNK1的受抑可逆轉(zhuǎn)RANKL抑制的Beclin1與Bcl-2的結(jié)合RANKL干預(yù)后,Beclin1與Bcl-2的相互結(jié)合減弱;但用抑制劑使JNK1受抑或使JNK1基因沉默后,兩者的相互結(jié)合又得到增強(qiáng)。第四部分IL-17A通過RANKL-JNK1信號通路調(diào)控OCPs的自噬1.低濃度IL-17A能增加OCPs的自噬,而高水平IL-17A呈相反結(jié)果2.自噬抑制可減少由IL-17A促進(jìn)的破骨細(xì)胞形成3.JNK1信號介導(dǎo)IL-17A促進(jìn)的OCPs自噬主要結(jié)論:1.JNK1信號可通過自噬蛋白Beclin1介導(dǎo)RANKL誘導(dǎo)的OCPs自噬活化與破骨細(xì)胞形成;2.JNK1介導(dǎo)的自噬可能通過TRAF3的降解來誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成;3.RANKL介導(dǎo)的TRAF3降解只能依賴于RANKL下游信號激活的自噬;4.在破骨細(xì)胞形成中,OCPs自噬活化可伴隨凋亡的反向變化;5.TRAF3可介導(dǎo)OCPs凋亡并串聯(lián)起自噬和凋亡;6.JNK1介導(dǎo)的TRAF3降解可防止OCPs的凋亡;7.RANKL通過Bcl-2磷酸化影響OCPs的自噬活性;8.低濃度IL-17A可能通過RANKL-JNK1通路的激活增強(qiáng)OCPs的自噬反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R580
【圖文】：

E64d（溶酶體阻斷劑）試劑的配制：用 DMSO 溶解，配制儲存濃0.2μm 過濾膜過濾后分裝，存于-20℃，推薦使用濃度為 1ng/ml（1：1 PEPS A（溶酶體阻斷劑）試劑的配制：DMSO 溶解 5mg 粉劑（直接配制儲存濃度為 1 mg/ml，0.2μm 過濾膜過濾后分裝，存于-20℃，推g/ml（1:1000）。病毒真核表達(dá)載體 pEX-Beclin1/control-Lv105 的構(gòu)建與感染目的細(xì)eia 公司負(fù)責(zé)構(gòu)建和包裝）小鼠 Beclin1 基因序列（NC_000077.6）設(shè)計(jì)引物（見表 2.1），PCR 擴(kuò)uro-Lv105 載體（圖 2.1）使其線性化，并與雙鏈 DNA 連接，隨即轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)行 PCR 鑒定及測序。慢病毒的包裝：載體系統(tǒng)由目的載體和包sv-REV、pMDIg-pRRE 和 pMD2G）的混合包裝載體構(gòu)成。相同方法X-control-Lv105。將它們轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，抽提病毒，濃縮，使用 H1度測定，最后感染目的細(xì)胞。具體步驟如下：

/ml）的嘌呤霉素，篩選病毒成功感染的陽性細(xì)胞，以構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系:以酶解的化受感染的細(xì)胞，接種至 6 孔培養(yǎng)板中，添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育 48 小時(shí)。隨有合適篩選藥物的培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基，每 3 天換液一次，從而篩選出可穩(wěn)定細(xì)胞。3）感染成功的細(xì)胞不斷增殖而逐漸增加，隨著增長到約 90%融合時(shí)，胰酶消化代于 6 孔板中，隨著細(xì)胞增加，再依次傳代于 6cm 培養(yǎng)皿及 10 cm 培養(yǎng)皿；當(dāng) 10cm 后，部分細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，部分細(xì)胞進(jìn)行凍存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用。4）穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功后提取細(xì)胞總蛋白及 RNA，分別用 Western blotting 及PCR 方法從蛋白水平及 RNA 水平驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率（具體方法如下）。Westeting 及定量 PCR 結(jié)果提示較感染 LV-control 組細(xì)胞，感染 LV-Beclin1 組的細(xì)lin1 蛋白及 mRNA（BECN1）水平均顯著升高，表明慢病毒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)是成圖 2.2）。

通過翻譯水平的檢測，說明 siRNA 的轉(zhuǎn)染是成功的（圖2.3）。表 2.1 siRNA 序列siRNA Sequences（5'-3'） Sequences（5'-3'）TRAF3-siRNA GCAGTGAGCCTCACTGTTA Control-siRNA GCAAGCGTCACTCGGTTTAJNK1-siRNA GCACGTAGCTCCATCTAAA Control-siRNA GCAATCGCTACCTTCGAAA圖 2.3 通過 Western-Blot 檢測的 siRNA(si-TRAF3 或 si-JNK1)轉(zhuǎn)染RAW264.7 細(xì)胞后的內(nèi)源性表達(dá)水平2.2.2.5 Western blotting 實(shí)驗(yàn)1.以胰蛋白酶消化液收集細(xì)胞，用 PBS 緩沖液洗滌 3 次，每次 4℃、2500rpm 離心5 分鐘，棄掉上清液，用適量 4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上放置 1 小時(shí)，使細(xì)胞充分裂解。細(xì)胞裂解后，將細(xì)胞懸液于 4℃、13000rpm 離心 30 分鐘，上清液即為提

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本文編號：2753926