【摘要】：目的:研究細(xì)胞自噬在氟誘導(dǎo)成釉細(xì)胞凋亡中的作用。方法:體外培養(yǎng)小鼠成釉細(xì)胞系(LS8)。1.用Na F(0 m M、0.25 m M、0.5 m M、1 m M、2 m M、4 m M)分別處理細(xì)胞24 h、48 h和72 h:CCK8檢測(cè)各濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響。2.用Na F(0 m M、0.8 m M、1.2 m M、1.6 m M、3.2 m M)作用細(xì)胞24h:○1 DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變;○2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。3.設(shè)置正常對(duì)照組,及實(shí)驗(yàn)分組Na F(0.8 m M、1.2 m M、1.6 m M、3.2 m M)組,處理24 h后:○1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)及蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3II,Beclin-1的表達(dá)水平;○2免疫熒光檢測(cè)LC3II胞內(nèi)定位。4.設(shè)置正常對(duì)照組,陽性對(duì)照組Na F(1.6 m M)及實(shí)驗(yàn)組Na F+3-MA(5 m M/10 m M/15 m M)組:○1 q RT-PCR及Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3II,Beclin-1的表達(dá)水平;○2 DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)改變;○3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:1.Na F能呈劑量和時(shí)間依賴性抑制LS8細(xì)胞的生長(zhǎng),其半數(shù)抑制濃度(IC50)是1.59 mmol/L;DAPI染色提示:對(duì)照組細(xì)胞核完整,染色質(zhì)均一、無局部聚集。Na F干預(yù)組細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)不均,并有細(xì)胞核碎片,Na F濃度越高,核固縮程度及細(xì)胞核碎片越多。2.Na F(0 m M、0.8 m M、1.2 m M、1.6 m M、3.2 m M)處理LS8細(xì)胞24 h,其凋亡率分別是(2.267±0.27)%、(6±0.5)%、(15.7±2.4)%、(43.8±0.58)%,(64.63±0.38)%,表明細(xì)胞凋亡率隨著Na F濃度的增高而增高(P0.01)。3.Na F實(shí)驗(yàn)組處理24 h后與正常對(duì)照組相比,LS8細(xì)胞中LC3II與Beclin-1的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平隨著Na F濃度的增高而增高,在Na F(1.6 m M)時(shí)達(dá)到高峰(P0.01),在Na F(3.2 m M)時(shí)下降(P0.01);免疫熒光示:正常對(duì)照組LC3II細(xì)胞質(zhì)內(nèi)低水平表達(dá),胞漿內(nèi)呈均勻的微弱綠色熒光,Na F(1.6 m M)組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)熒光點(diǎn)數(shù)量及強(qiáng)度明顯強(qiáng)于對(duì)照組,且胞質(zhì)中出現(xiàn)聚集熒光斑點(diǎn)。4.Na F+3-MA(5 m M、10 m M、15 m M)處理細(xì)胞24 h后,與Na F(1.6 m M)組相比,LS8細(xì)胞中LC3II與Beclin-1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平明顯降低;DAPI染色提示:對(duì)照組細(xì)胞核完整,無局部致密濃染。Na F干預(yù)組出現(xiàn)細(xì)胞核固縮,染色質(zhì)聚集和細(xì)胞核碎片,Na F和3-MA聯(lián)用組對(duì)比空白組和Na F干預(yù)組,核固縮程度及細(xì)胞裂解增多明顯;正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.27±2.27)%,Na F(1.6 m M)組細(xì)胞凋亡增加,凋亡率為(43.8±0.58)%,Na F+3-MA(5 m M、10 m M、15 m M)組凋亡率分別為(55.17±0.22)%、(61.3±0.53)%、(78.4±0.85)%。結(jié)論:過量氟能抑制成釉細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,該作用與細(xì)胞的自噬水平有關(guān),Na F超過一定濃度后,細(xì)胞的自噬作用降低,或用3-MA抑制其自噬反應(yīng)后,細(xì)胞凋亡增加,表明成釉細(xì)胞內(nèi)的自噬有抗凋亡作用,細(xì)胞自噬在氟化物對(duì)成釉細(xì)胞的損傷中起到了一定的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R781.2;R599.1
【圖文】：

圖 1 成釉細(xì)胞系 LS8 細(xì)胞鏡下觀察細(xì)胞增殖和凋亡的影響釉細(xì)胞增殖的影響0.25 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM）分別測(cè)不同濃度的 NaF 對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯殖抑制作用越強(qiáng)。NaF 濃度低于 0.5 mM 時(shí)，對(duì)度上升到 2 mM 時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制大于 50 NaF作用于LS8細(xì)胞24 h后，其半數(shù)抑制濃度（IC

圖 1 成釉細(xì)胞系 LS8 細(xì)胞鏡下觀察NaF 對(duì)成釉細(xì)胞增殖和凋亡的影響1 NaF 對(duì)成釉細(xì)胞增殖的影響NaF（0 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM）分別處理 LS8 ，用 CCK8 檢測(cè)不同濃度的 NaF 對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示：隨著 N高，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用越強(qiáng)。NaF 濃度低于 0.5 mM 時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制0.01）；當(dāng)濃度上升到 2 mM 時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制大于 50 % (P<0.05)，制程度增強(qiáng)。NaF作用于LS8細(xì)胞24 h后，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.59 m

圖 3 NaF 不同濃度下 24 h、48 h、72 h 對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響注：*、#、+或**、##、++分別表示與對(duì)照組相比 P<0.05 或 P<0.01釉細(xì)胞核形態(tài)變化濃度 NaF 作用 LS8 細(xì)胞 24 h 后，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照，無缺損，為橢圓形，呈淺藍(lán)色，染色質(zhì)均一；0.8 mM 組有少量，熒光變強(qiáng)；1.2 mM 組細(xì)胞核固縮數(shù)量較前組增多，少量細(xì)胞核色；1.6 mM 組與 3.2 mM 組細(xì)胞核固縮與細(xì)胞核裂解碎片較低濃現(xiàn)大小不等的圓形小體（凋亡小體），且 3.2 mM 組較 1.6 mM 組亡小體增多，染色質(zhì)聚集更加明顯。表明隨著 NaF 濃度的增高對(duì)重（圖 4）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2749722