【摘要】：目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種常見的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病,女性發(fā)病明顯多于男性,約為9:1。其病程遷延反復(fù),臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,可引起多組織、器官的損傷。其致病機(jī)制至今尚未明確,普遍認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、激素、免疫等多種因素有關(guān)。雖然糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑的合理應(yīng)用可明顯緩解SLE患者的病情和預(yù)后判斷,但該病的治療現(xiàn)狀仍不盡如人意,在治療過程中還要面臨復(fù)發(fā)等嚴(yán)峻問題。目前,SLE的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴于抗核抗體、抗雙鏈DNA、抗Sm等自身抗體,但這些自身抗體存在敏感性或特異性差的缺陷,大大限制其臨床價(jià)值。因此,迫切需要建立新技術(shù)和發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物來解決這些問題。環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型RNA分子,具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。諸多研究發(fā)現(xiàn)circRNA參與了疾病的發(fā)生發(fā)展,包括自身免疫性疾病。因此,尋找SLE患者中異常表達(dá)的circRNA,探討circRNA與SLE發(fā)病及其病程的關(guān)聯(lián),有助于闡明SLE的發(fā)病機(jī)制,為SLE的診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。方法:1.本項(xiàng)目采用病例對照研究,收集30對SLE患者和正常健康對照的血漿標(biāo)本,6對用于基因芯片技術(shù)篩選其血漿中差異表達(dá)的circRNAs。24對用于qRT-PCR技術(shù)初步驗(yàn)證顯著差異表達(dá)的circRNAs。2.應(yīng)用 TargetScan、miRbase、miRanda、GO和 KEGG 等數(shù)據(jù)庫對顯著差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行深度生物信息學(xué)分析,進(jìn)行靶基因預(yù)測及信號通路分析。3.應(yīng)用 qRT-PCR 技術(shù)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證 hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226在43例SLE患者、40例正常對照和36例疾病對照血漿中的表達(dá)情況,分析其表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性并評價(jià)其診斷效能。4.分離SLE患者和正常健康對照者外周血中的PBMC,檢測hsa_circ_400011和hsa_circ_100226在PBMC中的表達(dá)水平及評價(jià)其診斷效能。同時(shí)檢測經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測分析的hsa_circ_400011和hsa_circ_100226對應(yīng)的miRNAs在PBMC中的表達(dá)情況。結(jié)果:1.circRNA芯片的篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SLE患者血漿中共篩選出207個(gè)差異表達(dá)的circRNAs,其中113個(gè)基因表達(dá)上調(diào),94個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。挑選了差異倍數(shù)大且P值小的5個(gè)表達(dá)上調(diào)和3個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNAs分子進(jìn)行初步驗(yàn)證,結(jié)果顯示,hsa_circ_101471、hsa_circ_102584 和 hsa_circ_400011 表達(dá)上調(diào)與芯片結(jié)果一致,hsa_circ_100226表達(dá)下調(diào)與芯片結(jié)果一致。2.對差異表達(dá)顯著的circRNAs進(jìn)行了深入生物信息學(xué)分析,預(yù)測了其靶基因,通過GO分析和KEGG Pathway分析,構(gòu)建了 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖。發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_100226可能在與SLE疾病相關(guān)的renal cell carcinoma通路中發(fā)揮重要作用。hsa_circRNA_100226可能通過抑制miRNA水平影響靶基因Ets-1表達(dá),進(jìn)而影響SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。3.擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證hsa_circ_400011和hsa_circ_100226在血漿中的表達(dá)情況,結(jié)果表明,與正常對照和疾病對照相比,hsa_circ_400011在SLE患者血漿中的表達(dá)顯著升高(SLEvs Normal control:P=0.016;SLEvs Disease control:P=0.014),hsa_circ_100226在SLE患者血漿中的表達(dá)顯著降低(SLE vs Normal control:P=0.007;SLE vs Disease control:P=0.043),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。診斷效能評價(jià)顯示hsa_circ_400011和hsa_circ_100226的ROC曲線下面積均位于0.5-0.7之間,疾病識別能力較低。而二者分別與ANA聯(lián)合診斷的AUC為0.925和0.931,三者聯(lián)合診斷的AUC為0.921,均高于使用單一指標(biāo)診斷時(shí)的AUC,可提高診斷效能,提示hsa_circ_400011和hsa_circ_100226對SLE的診斷可能具有一定價(jià)值。其表達(dá)水平與SLE患者實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)的相關(guān)性分析表明,血肌酐升高組與非血肌酐升高組間的hsa_circ_1 00226表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z 血肌酐升高=-2.307,P血肌酐升高=0.021),未發(fā)現(xiàn) hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226與其他疾病相關(guān)檢測指標(biāo)之間的相關(guān)性。穩(wěn)定期和活動(dòng)期的SLE患者之間,hsa_circ_400011和hsa_circ_100226的表達(dá)均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.經(jīng) qRT-PCR 檢測 PBMC 中 hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226 的表達(dá)結(jié)果顯示,與正常對照相比,SLE患者PBMC中hsa_circ_400011的表達(dá)明顯升高,hsa_circ_100226的表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.026和0.000)。hsa_circ_400011 的 ROC 曲線下面積為 0.624,診斷效率較低;hsa_circ_100226的ROC曲線下面積為0.738,有較好的診斷效能;二者聯(lián)合診斷的AUC為0.769,略高于單一診斷,可提高診斷效能。此外,miRNAs在PBMC中的表達(dá)情況顯示,與正常對照相比,hsa_circ_400011對應(yīng)的miRNAs分子:hsa-miR-296-3p,hsa-miR-146b-3p和hsa-miR-181d-3p的表達(dá)均明顯升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但與生物信息學(xué)預(yù)測分析不相符,說明hsa_circ_400011與這些miRNAs可能不存在競爭吸附關(guān)系;hsa_circ_100226對應(yīng)的miRNAs分子:hsa-miR-138-5p,hsa-miR-145-3p和hsa-miR-875-3p的表達(dá)顯著升高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與預(yù)測分析相符。推測hsa-_circ_100226/hsa-miR-875-3p/Ets-1途徑可能在SLE的致病過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)論:研究結(jié)果表明SLE患者血漿和PBMC中存在差異表達(dá)的circRNAs。hsaI_circ_400011表達(dá)水平顯著升高,hsa_circ_100226表達(dá)水平顯著降低,二者具有作為SLE分子標(biāo)志物的潛能并可能與SLE發(fā)病機(jī)制相關(guān)。hsa_circ_100226可能參與SLE疾病相關(guān)的renal cell carcinoma信號通路,通過競爭吸附miR-875-3p影響靶基因Ets-1的表達(dá),進(jìn)而影響SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.241
【圖文】：

圖１－１．研宄第一章的主要技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｔｕｄｙ邋１逡逑１５逡逑

完整的Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ應(yīng)具有明顯的２８ｓ邋ｒＲＮＡ和１８ｓ邋ｒＲＮＡ兩個(gè)電泳條帶，并且２８ｓ逡逑ｒＲＮＡ條帶的亮度較高，約是１８ｓ邋ｒＲＮＡ亮度的兩倍。本實(shí)驗(yàn)中１２例樣本Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑的完整性檢測結(jié)果可見圖１－２所示。逡逑表１－４．邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋ＮＤ－１０００檢測總ＲＮＡ質(zhì)量結(jié)果逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－４．邋ＲＮＡ邋Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ａｓｓｕｒａｎｃｅ邋ｂｙ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋ＮＤ－１０００逡逑Ｓａｍｐｌｅ邋ＯＤ２６０／２８０邋ＯＤ２６０／２３０邐ＱＣ邋ｒｅｓｕｌｔ逡逑Ｃｏｎｃ．（ｎｇ／｜ｊＪ）邋Ｖｏｌｕｍｅ（ｊｘｌ）邋Ｑｕａｎｔｉｔｙ（ｎｇ）逡逑ＩＤ邋Ｒａｔｉｏ邐Ｒａｔｉｏ邐Ｐａｓｓ邋ｏｒ邋Ｆａｉｌ逡逑Ｃｌ邐１．７７邐０．９６邐２４５．８２邐１０邐２４５８．２０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ２邐１．６６邐０．７５邐２１３．０１邐１０邐２１３０．１０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ３邐１．６２邐０．６３邐２１７．１３邐１０邐２１７１．３０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ４邐１．４５邐０．４８邐２０８．２７邐１０邐２０８２．７０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ５邐１．６７邐０．５１邐１

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 崔靜;朱鐵楠;趙永強(qiáng);張奉春;;系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并血栓性血小板減少性紫癜14例臨床分析[J];中華內(nèi)科雜志;2013年05期

本文編號：2730002