【摘要】：目的:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種常見的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病,女性發(fā)病明顯多于男性,約為9:1。其病程遷延反復,臨床表現(xiàn)復雜多樣,可引起多組織、器官的損傷。其致病機制至今尚未明確,普遍認為與遺傳、環(huán)境、激素、免疫等多種因素有關。雖然糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制劑的合理應用可明顯緩解SLE患者的病情和預后判斷,但該病的治療現(xiàn)狀仍不盡如人意,在治療過程中還要面臨復發(fā)等嚴峻問題。目前,SLE的實驗室診斷主要依賴于抗核抗體、抗雙鏈DNA、抗Sm等自身抗體,但這些自身抗體存在敏感性或特異性差的缺陷,大大限制其臨床價值。因此,迫切需要建立新技術和發(fā)現(xiàn)新的標志物來解決這些問題。環(huán)狀RNA(Circular RNA,circRNA)是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型RNA分子,具有閉合環(huán)狀結構,大量存在于真核轉錄組中。諸多研究發(fā)現(xiàn)circRNA參與了疾病的發(fā)生發(fā)展,包括自身免疫性疾病。因此,尋找SLE患者中異常表達的circRNA,探討circRNA與SLE發(fā)病及其病程的關聯(lián),有助于闡明SLE的發(fā)病機制,為SLE的診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。方法:1.本項目采用病例對照研究,收集30對SLE患者和正常健康對照的血漿標本,6對用于基因芯片技術篩選其血漿中差異表達的circRNAs。24對用于qRT-PCR技術初步驗證顯著差異表達的circRNAs。2.應用 TargetScan、miRbase、miRanda、GO和 KEGG 等數(shù)據(jù)庫對顯著差異表達的circRNAs進行深度生物信息學分析,進行靶基因預測及信號通路分析。3.應用 qRT-PCR 技術擴大樣本量驗證 hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226在43例SLE患者、40例正常對照和36例疾病對照血漿中的表達情況,分析其表達水平與實驗室指標的相關性并評價其診斷效能。4.分離SLE患者和正常健康對照者外周血中的PBMC,檢測hsa_circ_400011和hsa_circ_100226在PBMC中的表達水平及評價其診斷效能。同時檢測經(jīng)生物信息學預測分析的hsa_circ_400011和hsa_circ_100226對應的miRNAs在PBMC中的表達情況。結果:1.circRNA芯片的篩查結果發(fā)現(xiàn),在SLE患者血漿中共篩選出207個差異表達的circRNAs,其中113個基因表達上調,94個基因表達下調。挑選了差異倍數(shù)大且P值小的5個表達上調和3個表達下調的circRNAs分子進行初步驗證,結果顯示,hsa_circ_101471、hsa_circ_102584 和 hsa_circ_400011 表達上調與芯片結果一致,hsa_circ_100226表達下調與芯片結果一致。2.對差異表達顯著的circRNAs進行了深入生物信息學分析,預測了其靶基因,通過GO分析和KEGG Pathway分析,構建了 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡互作圖。發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_100226可能在與SLE疾病相關的renal cell carcinoma通路中發(fā)揮重要作用。hsa_circRNA_100226可能通過抑制miRNA水平影響靶基因Ets-1表達,進而影響SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。3.擴大樣本量驗證hsa_circ_400011和hsa_circ_100226在血漿中的表達情況,結果表明,與正常對照和疾病對照相比,hsa_circ_400011在SLE患者血漿中的表達顯著升高(SLEvs Normal control:P=0.016;SLEvs Disease control:P=0.014),hsa_circ_100226在SLE患者血漿中的表達顯著降低(SLE vs Normal control:P=0.007;SLE vs Disease control:P=0.043),均有統(tǒng)計學意義。診斷效能評價顯示hsa_circ_400011和hsa_circ_100226的ROC曲線下面積均位于0.5-0.7之間,疾病識別能力較低。而二者分別與ANA聯(lián)合診斷的AUC為0.925和0.931,三者聯(lián)合診斷的AUC為0.921,均高于使用單一指標診斷時的AUC,可提高診斷效能,提示hsa_circ_400011和hsa_circ_100226對SLE的診斷可能具有一定價值。其表達水平與SLE患者實驗室檢測指標的相關性分析表明,血肌酐升高組與非血肌酐升高組間的hsa_circ_1 00226表達水平差異有統(tǒng)計學意義(Z 血肌酐升高=-2.307,P血肌酐升高=0.021),未發(fā)現(xiàn) hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226與其他疾病相關檢測指標之間的相關性。穩(wěn)定期和活動期的SLE患者之間,hsa_circ_400011和hsa_circ_100226的表達均無顯著統(tǒng)計學差異。4.經(jīng) qRT-PCR 檢測 PBMC 中 hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226 的表達結果顯示,與正常對照相比,SLE患者PBMC中hsa_circ_400011的表達明顯升高,hsa_circ_100226的表達顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P分別為0.026和0.000)。hsa_circ_400011 的 ROC 曲線下面積為 0.624,診斷效率較低;hsa_circ_100226的ROC曲線下面積為0.738,有較好的診斷效能;二者聯(lián)合診斷的AUC為0.769,略高于單一診斷,可提高診斷效能。此外,miRNAs在PBMC中的表達情況顯示,與正常對照相比,hsa_circ_400011對應的miRNAs分子:hsa-miR-296-3p,hsa-miR-146b-3p和hsa-miR-181d-3p的表達均明顯升高,且具有統(tǒng)計學意義,但與生物信息學預測分析不相符,說明hsa_circ_400011與這些miRNAs可能不存在競爭吸附關系;hsa_circ_100226對應的miRNAs分子:hsa-miR-138-5p,hsa-miR-145-3p和hsa-miR-875-3p的表達顯著升高,且具有統(tǒng)計學意義,與預測分析相符。推測hsa-_circ_100226/hsa-miR-875-3p/Ets-1途徑可能在SLE的致病過程中發(fā)揮重要作用。結論:研究結果表明SLE患者血漿和PBMC中存在差異表達的circRNAs。hsaI_circ_400011表達水平顯著升高,hsa_circ_100226表達水平顯著降低,二者具有作為SLE分子標志物的潛能并可能與SLE發(fā)病機制相關。hsa_circ_100226可能參與SLE疾病相關的renal cell carcinoma信號通路,通過競爭吸附miR-875-3p影響靶基因Ets-1的表達,進而影響SLE疾病的發(fā)生發(fā)展。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R593.241
【圖文】：

圖１－１．研宄第一章的主要技術路線圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｔｕｄｙ邋１逡逑１５逡逑

完整的Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ應具有明顯的２８ｓ邋ｒＲＮＡ和１８ｓ邋ｒＲＮＡ兩個電泳條帶，并且２８ｓ逡逑ｒＲＮＡ條帶的亮度較高，約是１８ｓ邋ｒＲＮＡ亮度的兩倍。本實驗中１２例樣本Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑的完整性檢測結果可見圖１－２所示。逡逑表１－４．邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋ＮＤ－１０００檢測總ＲＮＡ質量結果逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－４．邋ＲＮＡ邋Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ａｓｓｕｒａｎｃｅ邋ｂｙ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋ＮＤ－１０００逡逑Ｓａｍｐｌｅ邋ＯＤ２６０／２８０邋ＯＤ２６０／２３０邐ＱＣ邋ｒｅｓｕｌｔ逡逑Ｃｏｎｃ．（ｎｇ／｜ｊＪ）邋Ｖｏｌｕｍｅ（ｊｘｌ）邋Ｑｕａｎｔｉｔｙ（ｎｇ）逡逑ＩＤ邋Ｒａｔｉｏ邐Ｒａｔｉｏ邐Ｐａｓｓ邋ｏｒ邋Ｆａｉｌ逡逑Ｃｌ邐１．７７邐０．９６邐２４５．８２邐１０邐２４５８．２０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ２邐１．６６邐０．７５邐２１３．０１邐１０邐２１３０．１０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ３邐１．６２邐０．６３邐２１７．１３邐１０邐２１７１．３０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ４邐１．４５邐０．４８邐２０８．２７邐１０邐２０８２．７０邐Ｐａｓｓ逡逑Ｃ５邐１．６７邐０．５１邐１

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 崔靜;朱鐵楠;趙永強;張奉春;;系統(tǒng)性紅斑狼瘡合并血栓性血小板減少性紫癜14例臨床分析[J];中華內科雜志;2013年05期

本文編號：2730002