【摘要】：Ⅱ型糖尿病(T2DM)是嚴(yán)重影響身體健康、對(duì)家庭經(jīng)濟(jì)造成多重影響的一種慢性疾病。當(dāng)前越來(lái)越多的證據(jù)表明,T2DM可以增加患癌的風(fēng)險(xiǎn)及癌癥差的預(yù)后。然而,人們對(duì)T2DM與癌癥之間的生物學(xué)聯(lián)系,和T2DM引發(fā)癌癥的分子機(jī)制還知之甚少。中心體擴(kuò)增已被證實(shí)是腫瘤的特征之一,并且中心體擴(kuò)增可以誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生,增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。同時(shí),也與較差的癌癥預(yù)后相關(guān)�？墒�,關(guān)于T2DM是否通過(guò)中心體擴(kuò)增而引發(fā)癌癥的研究,截至目前為止尚未見(jiàn)報(bào)道;而且T2DM是否引起中心體擴(kuò)增,以及造成中心體擴(kuò)增的分子機(jī)制研究也不清楚。本學(xué)位論文研究了體外模擬T2DM的病理生理?xiàng)l件,使用功能蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)與手段,尋找T2DM引起中心體擴(kuò)增的相關(guān)蛋白分子以及相關(guān)信號(hào)通路。驗(yàn)證了在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,同樣發(fā)生了中心體擴(kuò)增,并且與腦膠質(zhì)瘤的分期相關(guān)。研究?jī)?nèi)容包含以下四個(gè)部分:第一部分:利用功能蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究Ⅱ型糖尿病引起中心體擴(kuò)增的分子機(jī)制。最近研究報(bào)道,在結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株中,T2DM通過(guò)增強(qiáng)ROCK1/14-3-3σ復(fù)合體的表達(dá)、綁定和中心體移位來(lái)促進(jìn)中心體擴(kuò)增。使用功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略,利用HCT116細(xì)胞,進(jìn)一步研究了中心體擴(kuò)增的分子信號(hào)通路。以未處理的HCT116細(xì)胞為對(duì)照組,高糖、高脂、高胰島素的體外模擬T2DM的病理生理?xiàng)l件的HCT116細(xì)胞為處理組。使用免疫熒光法檢測(cè)了兩種類(lèi)型組別細(xì)胞中心體的擴(kuò)增情況。結(jié)果顯示,在處理組細(xì)胞中,發(fā)生了中度(3-5個(gè))中心體擴(kuò)增;使用2-DE方法分析了兩種類(lèi)型組別細(xì)胞的蛋白差異點(diǎn)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,處理組出現(xiàn)了9個(gè)差異蛋白,其中7個(gè)上調(diào),2個(gè)下調(diào);用多肽指紋圖譜法鑒定了9個(gè)蛋白的身份。蛋白免疫印跡法檢測(cè)了NPM、PCNA和14-3-3σ的蛋白表達(dá),結(jié)果和2-DE的相符。進(jìn)一步使用免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡法,檢測(cè)了NPM、PCNA和14-3-3σ之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示,NPM獨(dú)自引起中心體擴(kuò)增,PCNA通過(guò)ROCK1調(diào)控中心體擴(kuò)增。以上研究表明,在高糖、高脂、高胰島素的條件下,NPM活性增加可以誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增;同時(shí)PCNA和14-3-3σ表達(dá)增強(qiáng),增強(qiáng)了中心體的擴(kuò)增。第二部分:JNK1/Stat3信號(hào)通路負(fù)向調(diào)控中心體擴(kuò)增。中心體擴(kuò)增可以誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生,增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。那么,是否存在在T2DM的病理生理?xiàng)l件下的負(fù)向調(diào)控機(jī)制呢?鑒于此,使用蛋白質(zhì)免疫印跡法,檢測(cè)了對(duì)照組和處理組兩組細(xì)胞中JNK1和Stat3活性情況。結(jié)果顯示,在高糖、高脂、高胰島素條件下,JNK1和Stat3活性均被激活;通過(guò)JNK1和Stat3的沉默實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在處理組中,兩個(gè)蛋白被敲低之后均上調(diào)了中心體的擴(kuò)增;此外,構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-JNK1的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),處理組中JNK1的過(guò)表達(dá)下調(diào)了中心體的擴(kuò)增;同時(shí),使用蛋白質(zhì)免疫印跡法,檢測(cè)了JNK1和Stat3上下游之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn),JNK1是Stat3的上游效應(yīng)分子;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),JNK1和Stat3均影響了14-3-3σ的表達(dá),從而影響中心體擴(kuò)增。以上研究表明,高糖、高脂、高胰島素激活了JNK1-Stat3的信號(hào)通路,調(diào)控了下游效應(yīng)分子14-3-3σ,從而調(diào)控了細(xì)胞的中心體擴(kuò)增,為進(jìn)一步的癌癥預(yù)防奠定了理論基礎(chǔ)。第三部分:Hsp74/14-3-3σ復(fù)合體介導(dǎo)中心體擴(kuò)增。功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),T2DM通過(guò)增強(qiáng)14-3-3σ的表達(dá)來(lái)促進(jìn)中心體擴(kuò)增,而JNK1-Stat3也通過(guò)14-3-3σ負(fù)向調(diào)控了中心體擴(kuò)增。在本研究中,進(jìn)一步研究了T2DM在生理病理?xiàng)l件下,14-3-3σ的特征及其相互作用的蛋白質(zhì)。采用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析,確認(rèn)了與14-3-3σ互作的134個(gè)蛋白質(zhì),其中包括70kDa熱休克蛋白4(Hsp74)。GO分析顯示,這些蛋白質(zhì)中有許多具有豐富的結(jié)合活性。KEGG分析顯示,處于前3位的富集途徑為核糖體、碳代謝和氨基酸生物合成。分子和功能的研究揭示,實(shí)驗(yàn)處理后增加了14-3-3σ/Hsp74的表達(dá)和綁定以及中心體擴(kuò)增。但是,使用siRNA-14-3-3σ和siRNA-Hsp74處理后,抑制了處理組增加的表達(dá)、綁定和中心體擴(kuò)增。此外,分子對(duì)接分析表明,14-3-3σ/Hsp74相互作用,主要是通過(guò)疏水作用力和一個(gè)較小程度上離子鍵和氫鍵。總之,研究結(jié)果表明,T2DM通過(guò)14-3-3σ和Hsp74的表達(dá)和綁定引起了中心體擴(kuò)增。第四部分:腦膠質(zhì)瘤中心體的異常擴(kuò)增及其和疾病分期的相關(guān)性。研究報(bào)道,在各種類(lèi)型的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了中心體擴(kuò)增。但是,關(guān)于中心體擴(kuò)增與腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系及其與疾病分期的相關(guān)報(bào)道還很少。因此,本研究使用HE染色法,將收集到的40例膠質(zhì)瘤標(biāo)本和10例正常腦組織標(biāo)本進(jìn)行分級(jí);使用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了Ki67和γ-tubulin蛋白表達(dá)。結(jié)果表明,Ki67在正常腦組織中沒(méi)有表達(dá),但在/級(jí)、級(jí)和V級(jí)中,陽(yáng)性表達(dá)率分別為65%、80%和100%,各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),說(shuō)明Ki67的表達(dá)與膠質(zhì)瘤級(jí)別相關(guān);同時(shí),g-tubulin蛋白在各個(gè)標(biāo)本中的表達(dá)率分別為:30%、50%、80%和100%,各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),說(shuō)明膠質(zhì)瘤級(jí)別升高,中心體擴(kuò)增率增加;使用免疫熒光檢測(cè)各級(jí)別組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn),中心體擴(kuò)增率和腦膠質(zhì)瘤的級(jí)別呈正相關(guān)。總而言之,中心體擴(kuò)增是腦膠質(zhì)瘤的惡性程度的特征之一,并且與膠質(zhì)瘤發(fā)病階段有關(guān),提示中心體擴(kuò)增和腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展具有密切的相關(guān)性。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),T2DM的病理生理?xiàng)l件引起了細(xì)胞中心體的擴(kuò)增,且揭示了相關(guān)的分子機(jī)制;在腦膠質(zhì)瘤中不但發(fā)現(xiàn)了中心體的擴(kuò)增,而且還和疾病的分期相關(guān)。因此,中心體擴(kuò)增分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn),將有助于開(kāi)發(fā)抑制T2DM引起中心體擴(kuò)增的方法。本研究有助于闡明T2DM引起中心體擴(kuò)增的分子機(jī)制,但對(duì)于是否對(duì)癌癥的發(fā)生有促進(jìn)作用尚待探索。如果是這樣,那么抑制中心體擴(kuò)增對(duì)T2DM患者的癌癥預(yù)防將具有非常重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1
【圖文】：

2圖 1.1 中心體的結(jié)構(gòu)[6]A：中心體結(jié)構(gòu)模式圖；B：電鏡下的中心體結(jié)構(gòu)Fig. 1.1 The structure of centrosomeA: Schematic picture of centrosome; B: Electron micrograph of centrosome1.2 中心體的復(fù)制眾所周知，在有絲分裂的過(guò)程中，染色體總是忠實(shí)的分離到兩個(gè)子細(xì)胞中，這對(duì)于維持大多數(shù)（不是所有）生物體的遺傳穩(wěn)定性是至關(guān)重要的[7]。中心體和有絲分裂微管之間的相互作用導(dǎo)致了染色體精確地分離到兩個(gè)子細(xì)胞中。細(xì)胞分裂后每個(gè)子細(xì)胞中只含有一個(gè)中心體；就像 DNA 一樣，中心體在每個(gè)細(xì)胞周期中只能復(fù)制一次。中心體復(fù)制必須嚴(yán)格控制，因?yàn)槊總�(gè)母中心粒產(chǎn)生一個(gè)以上的中心粒就會(huì)導(dǎo)致中心體擴(kuò)增的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定。對(duì)于中心體復(fù)制周期的觀察，最早是通過(guò)電子顯微鏡確定的，根據(jù)細(xì)胞周期中中心粒對(duì)的形態(tài)來(lái)確定中心體復(fù)制周期。近年來(lái)，在非洲爪蟾蜍卵提取物和培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物

維連接兩個(gè)姐妹染色單體的著絲粒）是錯(cuò)誤的連接狀態(tài)（圖 1.2）。由于缺少連接以及姐妹著絲粒間缺少?gòu)埩Γ瑂yntely 和 monotely 連接方式激活了 SAC。如果完成了所有著絲粒的連接，滿足了 SAC 的檢測(cè)，則會(huì)啟動(dòng)有絲分裂的后期[24]。先前 Vogelstein 等人為了檢測(cè)染色體不穩(wěn)定性的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中 SAC 的保真度，使用諾考達(dá)唑干擾微管，來(lái)測(cè)定這些細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)。結(jié)果證明，在諾考達(dá)唑引起染色體不穩(wěn)定性的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中，染色體不穩(wěn)定性不會(huì)引起明顯的有絲分裂阻滯，提示染色體不穩(wěn)定性細(xì)胞缺乏一個(gè)積極檢測(cè)的 SAC[25]。但是，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，染色體不穩(wěn)定性細(xì)胞常表現(xiàn)為染色體滯后和后期橋接[26]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些表型是另一種錯(cuò)誤的微管-著絲粒連接類(lèi)型（merotely）引起的。Merotely 是紡錘體兩極的微管纖維連接一個(gè)著絲粒，重要的是，由于微管纖維連接到所有的著絲粒上，產(chǎn)生了足夠的張力，造成了 SAC 并沒(méi)有檢測(cè)到這個(gè)錯(cuò)誤連接（圖 1.2）。微管連接著絲粒是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，依賴于著絲粒與中心體核化的微管之間的距離[27]。這導(dǎo)致額外的中心體和/或染色體的存在延長(zhǎng)了紡錘體組裝的過(guò)程[28]。

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