【摘要】：研究背景糖尿病(DM)是一種代謝性疾病,存在胰島素分泌障礙和/或作用缺陷,以葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂肪代謝障礙為特征的一種慢性病,而β細(xì)胞功能減退是2型糖尿病進(jìn)展的主要原因。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是小腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的一種激素,由腸道L細(xì)胞分泌,可調(diào)節(jié)胰島素對攝食的反應(yīng),不僅能增加胰島素分泌量,同時(shí)也對胰高血糖素有抑制作用,并且還能刺激β細(xì)胞,使其增殖、分化及抑制其凋亡。髓源性生長因子(myeloid-derived growth factor,MYDGF)是一種新型骨髓源性分泌蛋白,由骨髓細(xì)胞產(chǎn)生。在測試重組蛋白對血清饑餓的培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)作用中發(fā)現(xiàn),MYDGF的細(xì)胞保護(hù)作用與AKT的磷酸化和細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。此外,外源性添加的MYDGF通過MEK信號(hào)通路促進(jìn)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖�；蚯贸齅YDGF的小鼠具有較大的梗塞瘢痕和減少的細(xì)胞增殖和血管生成;在缺血和再灌注后,正常骨髓的移植或重組MYDGF的補(bǔ)充可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。以上研究提示,MYDGF作為一種新型蛋白可能在心血管疾病治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。如上所述,MYDGF可以激活MEK信號(hào)通路,而MEK信號(hào)通路在GLP-1的合成與產(chǎn)生中也具有十分重要的作用,因此,我們猜想MYDGF是否可以通過激活MEK信號(hào)通路從而促進(jìn)GLP-1的分泌,最終降低糖尿病患者的血糖水平。研究目的本研究的目的是探索MYDGF對2型糖尿病小鼠腸道L細(xì)胞合成和分泌GLP-1的作用及潛在機(jī)制。方法我們委托上海南方模型生物技術(shù)有限公司使用C57BL/6小鼠為原型制作MYDGF-/-小鼠模型,使其交配以獲得同窩野生型和MYDGF-/-小鼠。將4周大的雄性SPF級(jí)C57BL/6背景MYDGF-/-小鼠及野生型小鼠,先高脂飲食喂養(yǎng)4周,再注射鏈脲佐菌素(STZ),以模擬2型糖尿病。體內(nèi)實(shí)驗(yàn),我們用2型糖尿病小鼠模型進(jìn)行相關(guān)研究,通過基因敲除減少循環(huán)中的MYDGF水平和外源性補(bǔ)充MYDGF,觀察MYDGF對小鼠腸道L細(xì)胞分泌GLP-1的影響及機(jī)制。第一部分,探索MYDGF敲除對小鼠腸道L細(xì)胞分泌GLP-1的影響。每周在固定時(shí)間測定各組小鼠的體重、攝食量以及空腹血糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組隨機(jī)挑選小鼠完善腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)及胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT),ELISA法檢測血清各代謝指標(biāo)水平;RT-PCR分析GLP-1原位基因gcg、、pc3的表達(dá)情況。取回腸組織免疫熒光分析腸道L細(xì)胞數(shù)量的變化情況。Western blot檢測GLP-1蛋白的表達(dá)情況。第二部分,探索外源性增加MYDGF對小鼠腸道L細(xì)胞分泌GLP-1的影響,我們通過尾靜脈注射AAV-MYDGF使小鼠體內(nèi)過表達(dá)MYDGF。干預(yù)之前,行腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)及胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT),干預(yù)后,每周在固定時(shí)間測定各組小鼠的攝食量、體重及空腹血糖,干預(yù)6周后,再次檢測IPGTT和ITT,ELISA法檢測血清各代謝指標(biāo)水平;RT-PCR分析GLP-1原位基因gcg、、pc3的表達(dá)情況。取回腸組織免疫熒光分析腸道L細(xì)胞數(shù)量的變化情況。Western blot檢測相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)的情況。第三部分,探索MYDGF對GLP-1的作用機(jī)制。我們利用siRNA/PKA和siRNA/MEK進(jìn)行干擾,檢測各組小鼠GLP-1的含量和蛋白質(zhì)表達(dá)情況,并檢測相關(guān)信號(hào)通路的信號(hào)蛋白表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn),我們選擇STC-1細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第一部分,研究MYDGF對STC-1細(xì)胞分泌GLP-1的影響。通過外源性補(bǔ)充重組MYDGF蛋白,檢測上清液及細(xì)胞中GLP-1的含量。第二部分,利用siRNA/PKA和siRNA/MEK進(jìn)行干擾,檢測各組細(xì)胞GLP-1分泌和表達(dá)情況,并檢測相關(guān)信號(hào)通路的信號(hào)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn),增加或減少循環(huán)內(nèi)的MYDGF水平不影響非糖尿病小鼠的糖脂代謝。但是MYDGF缺乏時(shí),糖尿病小鼠空腹血糖、HbA1c明顯升高,循環(huán)內(nèi)GLP-1含量明顯降低,回腸gcg,pc3表達(dá)減弱。而外源性補(bǔ)充后可使空腹血糖和HbA1c有所降低,也可增加循環(huán)內(nèi)GLP-1水平。補(bǔ)充MYDGF也可改善糖耐量,增加空腹及注射葡萄糖30min后的血漿胰島素水平,上調(diào)GLP-1原位基因gcg、、pc3的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)表明,MYDGF可以增加STC-1細(xì)胞GLP-1的分泌量,也可以增加gcg,pc3的表達(dá)。機(jī)制方面,補(bǔ)充MYDGF可顯著升高P-ERK1/2表達(dá)水平,同時(shí),也可升高P-PKA、P-GSK3β,促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)位。結(jié)論綜上所述,本研究首次證實(shí)MYDGF可能通過激活MEK/ERK信號(hào)通路及PKA/GSK3β/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)GLP-1分泌,從而使糖尿病小鼠的糖脂代謝水平得以改善。MYDGF可能在腸道L細(xì)胞分泌GLP-1的過程中扮演重要角色,這就為尋找糖尿病的預(yù)防及治療開辟了新的道路。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.1
【圖文】：

腸ＧＬＰ－１相關(guān)基因ｇｃｇ、ｐｃ３的表達(dá)無明顯影響（Ｐ＞０＿０５）。與非糖尿病組相比，ＷＴ逡逑和Ｋ０糖尿病組小鼠回腸ＧＬＰ－１相關(guān)基因ｇｃｇ、ｐｃ３的表達(dá)明顯下降，其中ＷＴ糖尿逡逑病小鼠的下降水平少低于Ｋ０糖尿病組（圖１－７，ＰＣ０．０５）。給ＷＴ和Ｋ０糖尿病組逡逑小鼠外源性補(bǔ)充ＡＡＶ－ＭＹＤＧＦ后，與ＡＡＶ－ＧＦＰ組相比，回腸ＧＬＰ－１相關(guān)基因ｇｃｇ、逡逑２１逡逑

Ａ：邋ＭＥＫ／ＥＲＫ信號(hào)通路蛋白表達(dá)量；Ｂ：各組小鼠ＧＬＰ－１分泌量；Ｃ：各組小鼠活性ＧＬＰ－１逡逑分泌量＊Ｐ＜０．０５與ｓｉＣｏｎ組比較逡逑圖３－２邋ｓｉＲＮＡ／ＭＥＫ可以抑制ＭＹＤＧＦ的作用逡逑Ｆｉｇ邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭＹＤＧＦ邋ｗａｓ邋ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ邋ｂｙ邋ｓｉＲＮＡ／ＭＥＫ邋ｉｎ邋ｄｉａｂｅｔｉｃ邋ｍｉｃｅ逡逑３．５．２邋ＭＹＤＧＦ邋可激活邋ＰＫＡ／ＧＳＫ３ｐ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋信號(hào)通路逡逑免疫印跡結(jié)果顯示，與非糖尿病小鼠（ｃｏｎｔｒｏｌ）相比，糖尿病小鼠ＰＫＡ，邋ＧＳＫ－３ｐ逡逑蛋白磷酸化水平明顯減少，胞漿Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ磷酸化水平增加，胞核ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ水平減少。逡逑其中ＫＯ糖尿病小鼠較ＷＴ糖尿病小鼠ＰＫＡ，ＧＳＫ－３Ｐ蛋白磷酸化水平更低，胞核逡逑Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ水平更低。采用ＡＡＶ－ＭＹＤＧＦ干預(yù)后，ＷＴ和ＫＯ糖尿病小鼠回腸ＰＫＡ，逡逑ＧＳＫ－３Ｐ蛋白a愃嶧驕擼麍F(tuán)ｐ－ｃａｔｅｎｉｎa愃嶧澆仙�，胞核７w悖幔簦澹睿椋釧藉義顯黽櫻鉅煊型臣蒲Р鉅歟ǎ校

本文編號(hào)：2725544