發(fā)布時間：2020-06-22 09:32

【摘要】：目的2型糖尿病的發(fā)病率逐年上升且有年輕化的趨勢,α-葡萄糖苷酶抑制劑與2型糖尿病的治療息息相關(guān),如何有效防治慢性病的發(fā)生發(fā)展成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域研究的一個熱點。環(huán)境中一些含酚類化合物在慢性病的防治中可能具有應(yīng)用價值。鄰苯三酚和單寧酸是環(huán)境中廣泛存在的多酚類有機化合物:鄰苯三酚可抑制乳腺導(dǎo)管癌原位擴散和癌細(xì)胞增值、抗感染、誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡等;單寧酸具有抗氧化、抗神經(jīng)炎癥、緩解阿爾茨海默癥、延緩糖尿病腎病等作用。據(jù)以往報道證實,它們可抑制多種酶活性,但對α-葡萄糖苷酶(α-GC)的活性抑制機制尚且不明。此外,其工業(yè)生產(chǎn)廢水也會對環(huán)境造成一定污染,因此,有效利用含酚廢水顯得十分重要。本實驗采用酶抑制動力學(xué)與計算機模擬相結(jié)合的方法探討鄰苯三酚和單寧酸分別對α-GC活性抑制及其結(jié)構(gòu)功能的影響,有助于幫助人們了解酚類物質(zhì)對α-GC的活性抑制機制,為2型糖尿病開發(fā)新的藥物研究提供一些新的理論方向和依據(jù)。方法本實驗方法主要有:(1)分別測量不同濃度的鄰苯三酚和單寧酸對α-GC的活性影響;(2)評估鄰苯三酚和單寧酸是否可逆性抑制α-GC以及抑制類型;(3)不同的作用時間下測定不同濃度的鄰苯三酚和單寧酸對酶的活性影響;(4)采用內(nèi)源熒光法和ANS結(jié)合熒光分析該酶的構(gòu)象及其表面疏水性的變化;(5)利用分子動力學(xué)和計算機模擬對接法來預(yù)測該酶三維立體結(jié)構(gòu)以及鄰苯三酚和單寧酸分別和α-GC相結(jié)合的位點及其相關(guān)殘基。結(jié)果鄰苯三酚以一種可逆的且相對緊密的方式與α-GC結(jié)合,呈典型的混合型抑制,評估其IC50=0.72±0.051 mM,Kl=0.37±0.018mM,其介導(dǎo)的酶失活沒有顯著的時間動力學(xué)過程。內(nèi)源熒光及ANS結(jié)合熒光分析表明鄰苯三酚能誘導(dǎo)α-GC的三級結(jié)構(gòu)變化,與酶活性喪失有關(guān)(K=2.98±0.41 mM-1;n=11.01±0.09)。鄰苯三酚與α-GC活性中心的殘基(ASP68、MET69、TYR71、PHE157、PHE158、PHE177、GLN181、HIS348、ASP349、ASP406、VAL407、ASP408、ARG439和ARG443)相互作用。單寧酸能夠快速地、部分可逆的抑制α-GC活性,屬于一種斜率-拋物線性的混合型抑制類型,評估IC50=1.21±0.03 μM和Kl=0.41-±±0.032 μM,其介導(dǎo)的酶失活能夠迅速發(fā)生而沒有顯著的時間動力學(xué)過程。單寧酸誘導(dǎo)α-GC的部分區(qū)域結(jié)構(gòu)變化而不是整體的構(gòu)象變化,且不引起疏水表面暴露(K=0.42±0.44μM-1;n=1.89±0.11)。單寧酸與α-GC活性中心附近的殘基(MET69、TYR71、PHE177、ARG212、ASP214、GLU276、HIS348、ASP349和ARG439)相互作用。結(jié)論鄰苯三酚和單寧酸均能抑制α-GC的活性,且單寧酸抑制作用更強,其抑制機制分別是典型的純混合型和斜率-拋物線性混合型抑制。并且鄰苯三酚誘導(dǎo)α-GC整體結(jié)構(gòu)變化;單寧酸誘導(dǎo)α-GC部分區(qū)域性結(jié)構(gòu)變化。鄰苯三酚和單寧酸與α-GC活性中心附近的殘基相互作用,它們結(jié)構(gòu)中的酚羥基在配體結(jié)合和抑制機理中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1
【圖文】：

逡逑更為有趣的是，在圖３－１Ａ條件下繼續(xù)增大鄰苯三酚的濃度，ａ－ＧＣ不會完逡逑全失活（圖３－１Ｃ），這就意味著Ｅ－Ｉ－Ｓ復(fù)合物已形成了一個穩(wěn)定狀態(tài)。即使在高逡逑劑量的鄰苯三酚作用下，ｃｔ－ＧＣ也能維持其很低的殘留催化活性。逡逑Ａ邋１逡逑Ｓ邋Ｉ逡逑？？Ｓ邐６0－邐￡逡逑Ｉ邋４0－邋＼逡逑Ｉ８逡逑０邐２邐４邐６邐８邐１０逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑Ｂ邋ｍｔ逡逑＾邋８0－邋＼逡逑色邋＼逡逑安邋６０－逡逑卜逡逑？邋２0－逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０邐１００逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑ｃ邋１００＇逡逑８０－逡逑ｇ逡逑Ｃ＇邋６０－逡逑１逡逑＾邐４０－逡逑１邋Ｊ逡逑邐ｍ邐■邐■邐■逡逑0邐ｙ／．邐，邐，邐，邐，邐，邐逡逑０邐１０邐２０邐３０邐４０邐５０逡逑Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋（ｍＭ）逡逑圖３－１不同濃度鄰苯三酚對ｃｔ－ＧＣ的抑制作用。（Ａ）底物體系存在鄰苯三酚。（Ｂ）底物逡逑

如果它是不可逆的抑制，則抑制劑曲線與控制直線應(yīng)是相同的斜率，并且逡逑在與酶量相當(dāng)?shù)奈恢门c橫軸（［Ｅ］）相交。逡逑圖３－２中的數(shù)據(jù)證實了鄰苯三酚與ｃｔ－ＧＣ的可逆性結(jié)合，與圖３－１中所預(yù)測逡逑的結(jié)果一致。逡逑丨Ｄ逡逑０．００邐０．０５邐０．１０邐０．１５邐０．２０邐０．２５邐０．３０邐０．３５逡逑［Ｅ］邋（ｎｇ／ｍｌ）逡逑圖３－２不同濃度鄰苯三酚作用下，ａ－ＧＣ活力ｖ與酶濃度［Ｅ］的比較曲線圖。鄰苯三酚濃度逡逑從上到下分別為邋０邋ｍＭ邋（■）、０．２５邋ｍＭ邋（|r）、０．５邋ｍＭ邋（▲）、０．７５邋ｍＭ邋（%跡�、１．５邋ｍ冲（邋？）。辶x鮮笛樘跫跡常�。辶x希疲椋紓常插澹茫錚恚穡幔潁椋螅錚鑠澹錚駑澹幔牽緬澹幔悖簦椋觶椋簦澹鰣澹鰨椋簦楨澹澹睿恚邋澹悖錚睿悖澹睿簦潁幔簦椋錚鑠澹郟牛蒎澹酰睿洌澹蟈澹洌椋媯媯澹潁澹睿翦義希常插義

本文編號：2725540