【摘要】：目的:巨噬細胞內(nèi)攝并降解甘油三酯的功能在肥胖脂肪組織中受損會加重脂肪累積和脂肪細胞胰島素抵抗癥狀。ATP6V0d2作為V-ATPase的亞基之一,特異性高表達與巨噬細胞并可能影響溶酶體酸化及膜融合,與巨噬細胞降解功能密切相關(guān)。本論文探究巨噬細胞ATP6V0d2蛋白在脂肪代謝、肥胖發(fā)生發(fā)展,及胰島素抵抗病理進程中的作用。方法:1)構(gòu)建野生型與Atp6v0d2-/-小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型,觀測體重、體脂比、血脂、血糖水平變化;2)分離純化肥胖模型小鼠的骨髓來源巨噬細胞,流式細胞術(shù)檢測野生型與Atp6v0d2-/-小鼠巨噬細胞M1/M2極化差異;3)提取小鼠骨髓來源巨噬細胞、胚胎成纖維干細胞及成熟脂肪細胞蛋白,Western blot檢測ATP6V0d2蛋白在脂肪組織主要細胞組分中的表達水平;4)分離純化野生型與Atp6v0d2-/-小鼠骨髓來源巨噬細胞,模擬肥胖脂肪組織環(huán)境給予飽和脂肪酸刺激,油紅O染色細胞爬片,觀察細胞內(nèi)甘油三酯蓄積量差異;5)提取脂肪酸刺激后的野生型與Atp6v0d2-/-骨髓來源巨噬細胞的RNA,RT-PCR檢測脂肪合成與降解主要相關(guān)基因的m RNA水平;6)提取脂肪酸刺激前后的野生型小鼠骨髓來源巨噬細胞RNA,RT-PCR檢測Atp6v0d1和Atp6v0d2的m RNA水平變化;7)提取肥胖和正常野生型小鼠的骨髓來源巨噬細胞蛋白,Western blot檢測ATP6V0d2蛋白水平變化。結(jié)果:1)Atp6v0d2-/-肥胖小鼠體重增長率和基礎(chǔ)血糖水平高于野生型,且骨髓巨噬細胞M1型極化趨勢較強,M2型極化比例顯著低于野生型小鼠。2)脂肪組織中,巨噬細胞特異性高表達ATP6V0d2蛋白;脂肪酸刺激后Atp6v0d2-/-巨噬細胞的脂滴數(shù)量多于野生型,但脂肪代謝相關(guān)酶轉(zhuǎn)錄水平無統(tǒng)計學(xué)差異。3)脂肪酸刺激會下調(diào)巨噬細胞Atp6v0d2的m RNA水平,長期給予高脂飼料則可抑制野生型小鼠ATP6V0d2蛋白表達。結(jié)論:脂肪組織中,ATP6V0d2主要表達于巨噬細胞,參與巨噬細胞對甘油三酯的降解過程,但并非通過調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)酶轉(zhuǎn)錄起作用。ATP6V0d2蛋白缺失的小鼠巨噬細胞向M2型極化受抑制,體重增長加快,基礎(chǔ)血糖水平更高。此外,脂肪酸對于ATP6V0d2的轉(zhuǎn)錄和表達具有負向調(diào)節(jié)的作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R589.2
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié)果一、 ATP6V0d2 蛋白在小鼠肥胖發(fā)展中的作用1. Atp6v0d2-/-小鼠體重增長速度更快為了研究 ATP6V0d2 在肥胖過程中的作用，我們用 TALEN 技術(shù)構(gòu)建了Atp6v0d2 基因敲除小鼠，選取雄性 5-7 周體重接近的野生型和 Atp6v0d2-/-小鼠構(gòu)建高脂飲食肥胖模型。實驗發(fā)現(xiàn)在四組小鼠每周平均攝入熱量一致的前提下，高脂喂養(yǎng)自第 5 周起，Atp6v0d2-/-高脂組小鼠每周體重增長率逐漸高于野生型（P= 0.039），食用普通飼料的對照組則無差別；至第 11 周時，Atp6v0d2-/-高脂組小鼠體重增長率遠高于其他三組（圖 1）。這組數(shù)據(jù)顯示在攝入高脂飼料時，Atp6v0d2-/-小鼠的肥胖進程較野生型小鼠發(fā)展更快。

圖 2.高脂喂養(yǎng)的 Atp6v0d2-/-小鼠體脂比與野生型接近模型小鼠喂養(yǎng)至第 12 周稱量體重（A），測量小鼠腰圍（B）與體長（C）后，斷頸處死小鼠，解剖剝離肝臟、各主要白色脂肪部分稱重，計算其與體重之比（D）。圖 3. Atp6v0d2-/-小鼠血脂水平與野生型接近

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本文編號：2722368