【摘要】：1前言百草枯(Paraquat,PQ),一種高效的吡啶類觸殺型高效除草劑,化學(xué)分子為1,1'-二甲基-4,4'-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽,。自1960年以來(lái),在全世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛使用。即使攝入少量PQ,也會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物產(chǎn)生很強(qiáng)的毒性,由于缺乏強(qiáng)有效解毒藥物,中毒后致死率非常高。特別是在發(fā)展中國(guó)家居中的亞洲,每年大約有數(shù)千人在使用PQ意外中毒或服用后中毒,其死亡率在60-70%之間。肺臟是PQ中毒的主要靶器官。PQ在肺部聚集,引起肺的水腫、出血和滲出,炎性浸潤(rùn)肺間質(zhì)和肺泡,成纖維細(xì)胞增殖和過(guò)多的膠原蛋白沉積,肺上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞的損傷最終導(dǎo)致肺纖維化。中毒后患者的典型表現(xiàn)為“百草枯肺”,中毒早期主要表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),后期會(huì)發(fā)生不可逆性的肺間質(zhì)纖維化,最終,患者多死于呼吸衰竭。目前,PQ中毒引起肺損傷的確切機(jī)制尚不完全清楚。但大多數(shù)研究證實(shí)PQ誘導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基,是肺損傷的重要原因。大量活性氧(ROS)氧化不同生物膜上的不飽和脂肪酸,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián),進(jìn)一步引起肺損傷。近年來(lái),很多研究針對(duì)減少ROS的生成、清除生成的ROS以及減少炎癥反應(yīng)等方面。但是,上述治療效果仍不能降低高死亡率。因此,迫切需要尋找有效的治療方法。超氧化物歧化酶(SOD)減少氧化應(yīng)激起到保護(hù)作用在近幾年被廣泛報(bào)道,然而其在PQ誘導(dǎo)的肺損傷模型中的報(bào)道較少。研究表明,PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性增加導(dǎo)致錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的失活和活力下降。錳(Ⅲ)-四(4-N-甲基吡啶基)卟啉(MnTMPyP),是超氧化物歧化酶的一種模擬產(chǎn)物,可穿透細(xì)胞并有效清除細(xì)胞內(nèi)超氧化物離子。MnTMPyP抑制脂多糖誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生和多巴胺能神經(jīng)變性。在缺血-再灌注腎損傷模型中,MnTMPyP通過(guò)清除產(chǎn)生的自由基有效降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá),從而抑制了Caspase-3的活化。本文的目的是探討MnTMPyP是否減輕PQ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷肺上皮細(xì)胞的損傷以及機(jī)制研究。2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株:人肺上皮樣細(xì)胞-A549。2.2實(shí)驗(yàn)分組2.2.1 PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與線粒體凋亡途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(等量培養(yǎng)基)、MnTMPyP 10μM組、PQ 750μM組、PQ+MnTMPyP組,各組細(xì)胞處理24h后,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。2.2.2 MnTMPyP通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(等量培養(yǎng)基)、MnTMPyP 10μM組、PQ 750μM組、PQ+MnTMPyP組,各組細(xì)胞處理24h后,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。2.2.3 MnTMPyP通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(等量培養(yǎng)基)、MnTMPyP 10μM組、PQ 750μM組、PQ+MnTMPyP組,各組細(xì)胞處理24h后,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。2.3主要研究方法2.3.1建立PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡模型與線粒體凋亡途徑的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)(1)A549細(xì)胞培養(yǎng)及PQ處理細(xì)胞。(2)MnTMPyP預(yù)處理A549細(xì)胞。(3)MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞活性。(4)使用羅丹明(Rh)123染色后,在倒置熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞線粒體膜電位熒光強(qiáng)度;以及使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Rh 123染色后的細(xì)胞線粒體熒光強(qiáng)度。(5)Annexin V檢測(cè)試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率。(6)使用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)百草枯誘導(dǎo)A549細(xì)胞的Caspase-3活性。(7)活性氧檢測(cè)試劑盒DCFH-DA染色后,在倒置熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光強(qiáng)度;以及使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCFH-DA染色后的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。(8)Fluo-3/AM法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平。(9)谷胱甘肽還原酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶活性。(10)Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、Grp78、CHOP、β-actin蛋白表達(dá)量的變化。2.3.2 MnTMPyP通過(guò)抑制活性氧誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑,從而減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡(1)用MnTMPyP預(yù)處理,并檢測(cè)線粒體膜電位、凋亡率、細(xì)胞內(nèi)活性氧和Caspase-3活性。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、β-actin蛋白表達(dá)量的變化。2.3.3 MnTMPyP通過(guò)抑制活性氧誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,并減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的凋亡(1)使用MnTMPyP預(yù)處理,并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧、Ca~(2+)水平、谷胱甘肽還原酶活性檢測(cè)。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blot檢測(cè)Grp78、CHOP、β-actin蛋白表達(dá)量的變化。3結(jié)果3.1 PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡模型與線粒體凋亡途徑相關(guān)的指標(biāo)檢測(cè)(1)PQ對(duì)A549細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性,顯著降低細(xì)胞活力。(2)MnTMPyP預(yù)處理A549細(xì)胞后細(xì)胞活性較PQ組顯著增加。(3)使用Rh123染色后,熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞線粒體膜電位熒光強(qiáng)度;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞的線粒體熒光強(qiáng)度,結(jié)果顯示PQ組線粒體膜電位熒光強(qiáng)度較對(duì)照組顯著下降。(4)Annexin V檢測(cè)凋亡率,發(fā)現(xiàn)PQ組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組。(5)通過(guò)Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性,結(jié)果顯示PQ組Caspase-3活性較對(duì)照組增高顯著。(6)DCFH-DA染色后,熒光導(dǎo)致顯微鏡下觀察A549細(xì)胞內(nèi)活性氧的熒光強(qiáng)度,并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,結(jié)果顯示PQ組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著高于對(duì)照組。(7)Fluo-3/AM法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平,結(jié)果顯示PQ組細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平顯著高于對(duì)照組。(8)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶(GR)活性檢測(cè),結(jié)果顯示PQ組細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶活性較對(duì)照組顯著降低。(9)Western blot蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PQ組較Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降,Bax、Grp78、CHOP蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。3.2 MnTMPyP通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡(1)MnTMPyP預(yù)處理,顯著降低了PQ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率以及對(duì)線粒體膜電位的破壞,減少了活性氧的生成及抑制了Caspase-3的活性。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著增加,促進(jìn)凋亡蛋白BAX表達(dá)量顯著降低。3.3 MnTMPyP通過(guò)抑制活性氧引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,減弱PQ誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡(1)使用MnTMPyP預(yù)處理,顯著降低了PQ誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平,細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽活性顯著檢測(cè)。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白Grp78、CHOP表達(dá)量較PQ組顯著下降。4結(jié)論(1)PQ通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激激發(fā)線粒體凋亡途徑激發(fā)A549細(xì)胞凋亡。(2)PQ通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起A549細(xì)胞凋亡。(3)MnTMPyP通過(guò)抑制氧化應(yīng)激并緩解線粒體凋亡途徑而減少A549細(xì)胞凋亡。(4)MnTMPyP通過(guò)抑制氧化應(yīng)激并緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑而減少A549細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R595.4
【圖文】：

圖 1 各組細(xì)胞處理 24 h 后 MTT 法檢測(cè)的細(xì)胞活性。數(shù)據(jù)以 x±s**P <0.01，PQ 組與對(duì)照組比較；##P<0.01，與 PQ 組相比。3.1.2 MnTMPyP 減少 PQ 誘導(dǎo)的 A549 細(xì)胞內(nèi) ROS 生成按不同處理因素處理A549細(xì)胞24 h后，DCFH-DA法檢測(cè)與對(duì)照組相比，MnTMPyP組ROS稍增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意組ROS顯著增加（P<0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP處理水平顯著降低（P<0.01），表明MnTMPyP預(yù)處理有效減少A成。見(jiàn)圖2。A.

10B.圖2 各組細(xì)胞處理24 h后DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS。B.熒光顯微鏡檢測(cè) ROS 熒光強(qiáng)度(×400)。數(shù)據(jù)以 x±s 表示，獨(dú)立重復(fù) 3 次：**P <0.01，PQ組與對(duì)照組比較；##P<0.01，與 PQ 組相比。3.1.3 MnTMPyP 降低 PQ 誘導(dǎo)的 A549 細(xì)胞內(nèi)的 Ca2+水平對(duì)照組和 MnTMPyP 組細(xì)胞質(zhì)內(nèi) Ca2+無(wú)明顯升高(P>0.05)，與對(duì)照組相比，PQ 組 Ca2+水平顯著升高(P<0.01)；與 PQ 組相比，PQ+MnTMPyP 組 Ca2+水平明顯降低(P<0.01)，表明 MnTMPyP 預(yù)處理顯著降低 PQ 處理的細(xì)胞內(nèi) Ca2+水平。見(jiàn)圖 3。圖3 各組細(xì)胞處理24 h后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平。數(shù)據(jù)以 x±s表示，獨(dú)立重復(fù)3次：**P <0.01

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄧過(guò)房;;2016年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)背景下的細(xì)胞死亡方式再認(rèn)識(shí)[J];中學(xué)生物學(xué);2017年05期

2 寧旭;于忠鳴;;創(chuàng)造性的自主毀滅——細(xì)胞凋亡簡(jiǎn)介[J];中學(xué)生物學(xué);2006年10期

3 劉春秋;卞茂紅;;藥物致紅細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J];臨床輸血與檢驗(yàn);2017年04期

4 劉晨;馮雪;;人CXCR4基因?qū)σ认侔㏒W1990細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響[J];健康之路;2017年06期

5 王方;;過(guò)表達(dá)TIPE2上調(diào)BID分子促進(jìn)H446細(xì)胞凋亡[J];科學(xué)中國(guó)人;2017年18期

6 賈寧;孫榮釗;;病毒感染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制[J];中國(guó)動(dòng)物檢疫;2012年08期

7 趙君怡;劉偉國(guó);郭秀麗;;一氧化氮與細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的關(guān)系及其調(diào)控[J];中國(guó)藥學(xué)雜志;2010年14期

8 黃小丹;;細(xì)胞凋亡與疾病[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2009年05期

9 陳藝娟;鄧甲興;林永利;;中藥影響細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J];福建畜牧獸醫(yī);2008年01期

10 劉伍梅;汪銘書(shū);程安春;周毅;劉芳;張平英;李雪梅;陳孝躍;;PRRSV感染Marc-145細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2008年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李佑生;王文健;劉毅;何春燕;何燕銘;陳偉華;應(yīng)健;;黃芪多糖丹酚酸對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)血栓病分會(huì)第四次學(xué)術(shù)研討會(huì)暨廣東省中醫(yī)藥學(xué)會(huì)血栓病專業(yè)委員會(huì)首屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 覃玉榮;張志勇;;細(xì)胞濃度變化對(duì)細(xì)胞凋亡率影響及其機(jī)理初探[A];全國(guó)電磁兼容學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

3 于青;袁偉杰;姚建;;晚期糖基化終末產(chǎn)物引起足細(xì)胞凋亡的機(jī)制[A];2007年浙滬兩地腎臟病學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編[C];2007年

4 吳經(jīng)緯;湯長(zhǎng)發(fā);;運(yùn)動(dòng)中細(xì)胞凋亡的線粒體變化特征[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2006年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2007年

5 蒲小平;李長(zhǎng)齡;屠鵬飛;宋志宏;;中藥肉叢蓉成分抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[A];第七屆全國(guó)生化藥理學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2000年

6 符必謙;奚勝艷;王彥暉;;中藥及復(fù)方促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制[A];第二屆臨床中藥學(xué)大會(huì)論文集[C];2018年

7 林其誰(shuí);;線粒體與細(xì)胞凋亡[A];第七屆全國(guó)生物膜學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];1999年

8 邱潔;高海青;;鋅在細(xì)胞凋亡中的作用研究進(jìn)展[A];山東省微量元素科學(xué)研究會(huì)第三屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2006年

9 寧存德;;細(xì)胞凋亡與口腔疾病[A];FDI、CSA臨床口腔進(jìn)展學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];1999年

10 華子春;;靶向性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡藥物研發(fā)[A];全國(guó)第十一屆生化與分子藥理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 方方　曹雪琴;吳政星的挑戰(zhàn)與求索[N];科學(xué)時(shí)報(bào);2011年

2 實(shí)習(xí)生 劉雨亭;細(xì)胞凋亡如何推進(jìn)？以觸發(fā)波的“名義”[N];科技日?qǐng)?bào);2018年

3 ;“細(xì)胞凋亡療法”正逐步成為治療癌癥的新途徑[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2002年

4 記者 何德功;基因變異可能致癲癇[N];新華每日電訊;2004年

5 ;3’取代吲哚類衍生物誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

6 ;As_(2)S_(2)與STI571協(xié)同誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

7 董學(xué)清 吳延華;阿膠抑癌作用顯著[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

8 高書(shū)明;誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

9 楊堤林;中藥可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2004年

10 記者張建松;治療癌癥新途徑：細(xì)胞凋亡療法[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 康星;土木香內(nèi)酯和丹參酮Ⅰ誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡作用及其分子機(jī)制的研究[D];西北大學(xué);2019年

2 何飛;HMGB1/RAGE軸介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)通路在急性呼吸窘迫綜合征中的作用機(jī)制研究[D];南京大學(xué);2019年

3 李志良;壓力經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)髓核干細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2019年

4 郭召;miRNA-502在椎間盤(pán)髓核細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及干預(yù)機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2019年

5 耿剛;KIF3A基因與哮喘氣道炎癥及氣道上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

6 吳曉龍;基于線粒體融合與分裂研究中醫(yī)扶正與祛邪療法誘導(dǎo)人急性髓系白血病KG-1a細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2018年

7 鄭王龍;玉米赤霉烯酮致睪丸支持細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨架損傷的分子機(jī)制[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

8 李玉明;豬繁殖與呼吸綜合征病毒誘導(dǎo)bystander細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

9 魏薇;我國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株致密顆粒蛋白15誘導(dǎo)人絨毛膜細(xì)胞JEG-3凋亡的機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

10 徐祥;Nupr1及C/EBPβ在甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉欣鑫;堿蓬多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的研究[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2019年

2 崔偉;Klotho蛋白對(duì)H_2O_2引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的研究[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2019年

3 林登強(qiáng);Apogossypolone誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及逆轉(zhuǎn)EMT的作用機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2018年

4 王薛;HBx基因?qū)π∈蟾闻K細(xì)胞凋亡和周期影響的體內(nèi)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2019年

5 段世豪;下調(diào)熱休克蛋白60對(duì)MDCC-MSB1細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用[D];聊城大學(xué);2019年

6 關(guān)茗洋;基于肺組織芯片研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在PM2.5誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡中的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2019年

7 李洋;基于黃酮骨架的氨基酸衍生物的合成及其抗癌活性研究[D];南華大學(xué);2019年

8 李婷;綠膿菌素通過(guò)線粒體損傷和細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的升高誘導(dǎo)NK92細(xì)胞凋亡[D];杭州師范大學(xué);2019年

9 陳明;伏立諾他協(xié)同PI3K抑制劑NVP-BEZ235誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡[D];南華大學(xué);2019年

10 王冉;鈦鉭生物梯度復(fù)合材料生物安全性的研究[D];華北理工大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2720440