【摘要】：1前言百草枯(Paraquat,PQ),一種高效的吡啶類觸殺型高效除草劑,化學分子為1,1'-二甲基-4,4'-聯(lián)吡啶陽離子鹽,。自1960年以來,在全世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到了廣泛使用。即使攝入少量PQ,也會對人類和動物產(chǎn)生很強的毒性,由于缺乏強有效解毒藥物,中毒后致死率非常高。特別是在發(fā)展中國家居中的亞洲,每年大約有數(shù)千人在使用PQ意外中毒或服用后中毒,其死亡率在60-70%之間。肺臟是PQ中毒的主要靶器官。PQ在肺部聚集,引起肺的水腫、出血和滲出,炎性浸潤肺間質(zhì)和肺泡,成纖維細胞增殖和過多的膠原蛋白沉積,肺上皮細胞及支氣管上皮細胞的損傷最終導(dǎo)致肺纖維化。中毒后患者的典型表現(xiàn)為“百草枯肺”,中毒早期主要表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),后期會發(fā)生不可逆性的肺間質(zhì)纖維化,最終,患者多死于呼吸衰竭。目前,PQ中毒引起肺損傷的確切機制尚不完全清楚。但大多數(shù)研究證實PQ誘導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量的氧自由基,是肺損傷的重要原因。大量活性氧(ROS)氧化不同生物膜上的不飽和脂肪酸,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和細胞凋亡級聯(lián),進一步引起肺損傷。近年來,很多研究針對減少ROS的生成、清除生成的ROS以及減少炎癥反應(yīng)等方面。但是,上述治療效果仍不能降低高死亡率。因此,迫切需要尋找有效的治療方法。超氧化物歧化酶(SOD)減少氧化應(yīng)激起到保護作用在近幾年被廣泛報道,然而其在PQ誘導(dǎo)的肺損傷模型中的報道較少。研究表明,PQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞內(nèi)線粒體通透性增加導(dǎo)致錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的失活和活力下降。錳(Ⅲ)-四(4-N-甲基吡啶基)卟啉(MnTMPyP),是超氧化物歧化酶的一種模擬產(chǎn)物,可穿透細胞并有效清除細胞內(nèi)超氧化物離子。MnTMPyP抑制脂多糖誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生和多巴胺能神經(jīng)變性。在缺血-再灌注腎損傷模型中,MnTMPyP通過清除產(chǎn)生的自由基有效降低促凋亡蛋白Bax的表達,從而抑制了Caspase-3的活化。本文的目的是探討MnTMPyP是否減輕PQ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷肺上皮細胞的損傷以及機制研究。2材料與方法2.1實驗材料細胞株:人肺上皮樣細胞-A549。2.2實驗分組2.2.1 PQ誘導(dǎo)A549細胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與線粒體凋亡途徑相關(guān)指標的檢測實驗分組:對照組(等量培養(yǎng)基)、MnTMPyP 10μM組、PQ 750μM組、PQ+MnTMPyP組,各組細胞處理24h后,檢測相關(guān)指標。2.2.2 MnTMPyP通過抑制線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細胞凋亡實驗分組:對照組(等量培養(yǎng)基)、MnTMPyP 10μM組、PQ 750μM組、PQ+MnTMPyP組,各組細胞處理24h后,檢測相關(guān)指標。2.2.3 MnTMPyP通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細胞凋亡實驗分組:對照組(等量培養(yǎng)基)、MnTMPyP 10μM組、PQ 750μM組、PQ+MnTMPyP組,各組細胞處理24h后,檢測相關(guān)指標。2.3主要研究方法2.3.1建立PQ誘導(dǎo)A549細胞凋亡模型與線粒體凋亡途徑的相關(guān)指標檢測(1)A549細胞培養(yǎng)及PQ處理細胞。(2)MnTMPyP預(yù)處理A549細胞。(3)MTT法檢測A549細胞活性。(4)使用羅丹明(Rh)123染色后,在倒置熒光顯微鏡下觀察A549細胞線粒體膜電位熒光強度;以及使用流式細胞儀檢測Rh 123染色后的細胞線粒體熒光強度。(5)Annexin V檢測試劑盒檢測A549細胞凋亡率。(6)使用Caspase-3活性檢測試劑盒檢測百草枯誘導(dǎo)A549細胞的Caspase-3活性。(7)活性氧檢測試劑盒DCFH-DA染色后,在倒置熒光顯微鏡下觀察A549細胞內(nèi)活性氧熒光強度;以及使用流式細胞儀檢測DCFH-DA染色后的細胞內(nèi)活性氧水平。(8)Fluo-3/AM法檢測細胞內(nèi)Ca~(2+)水平。(9)谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶活性。(10)Western blot檢測Bcl-2、Bax、Grp78、CHOP、β-actin蛋白表達量的變化。2.3.2 MnTMPyP通過抑制活性氧誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑,從而減弱PQ誘導(dǎo)的A549細胞凋亡(1)用MnTMPyP預(yù)處理,并檢測線粒體膜電位、凋亡率、細胞內(nèi)活性氧和Caspase-3活性。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blot檢測Bax、Bcl-2、β-actin蛋白表達量的變化。2.3.3 MnTMPyP通過抑制活性氧誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,并減弱PQ誘導(dǎo)的A549細胞的凋亡(1)使用MnTMPyP預(yù)處理,并檢測細胞內(nèi)活性氧、Ca~(2+)水平、谷胱甘肽還原酶活性檢測。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blot檢測Grp78、CHOP、β-actin蛋白表達量的變化。3結(jié)果3.1 PQ誘導(dǎo)的A549細胞凋亡模型與線粒體凋亡途徑相關(guān)的指標檢測(1)PQ對A549細胞具有顯著的細胞毒性,顯著降低細胞活力。(2)MnTMPyP預(yù)處理A549細胞后細胞活性較PQ組顯著增加。(3)使用Rh123染色后,熒光顯微鏡下觀察A549細胞線粒體膜電位熒光強度;通過流式細胞術(shù)測量細胞的線粒體熒光強度,結(jié)果顯示PQ組線粒體膜電位熒光強度較對照組顯著下降。(4)Annexin V檢測凋亡率,發(fā)現(xiàn)PQ組細胞凋亡率明顯高于對照組。(5)通過Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3活性,結(jié)果顯示PQ組Caspase-3活性較對照組增高顯著。(6)DCFH-DA染色后,熒光導(dǎo)致顯微鏡下觀察A549細胞內(nèi)活性氧的熒光強度,并使用流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)活性氧水平,結(jié)果顯示PQ組細胞內(nèi)活性氧水平顯著高于對照組。(7)Fluo-3/AM法檢測細胞內(nèi)Ca~(2+)水平,結(jié)果顯示PQ組細胞內(nèi)Ca~(2+)水平顯著高于對照組。(8)細胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶(GR)活性檢測,結(jié)果顯示PQ組細胞內(nèi)谷胱甘肽還原酶活性較對照組顯著降低。(9)Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,PQ組較Bcl-2蛋白表達顯著下降,Bax、Grp78、CHOP蛋白表達顯著增強。3.2 MnTMPyP通過抑制線粒體凋亡途徑減弱PQ誘導(dǎo)的A549細胞凋亡(1)MnTMPyP預(yù)處理,顯著降低了PQ誘導(dǎo)細胞凋亡率以及對線粒體膜電位的破壞,減少了活性氧的生成及抑制了Caspase-3的活性。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blot檢測結(jié)果顯示,抑制凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著增加,促進凋亡蛋白BAX表達量顯著降低。3.3 MnTMPyP通過抑制活性氧引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,減弱PQ誘導(dǎo)A549細胞凋亡(1)使用MnTMPyP預(yù)處理,顯著降低了PQ誘導(dǎo)的細胞內(nèi)Ca~(2+)水平,細胞內(nèi)谷胱甘肽活性顯著檢測。(2)使用MnTMPyP預(yù)處理,Western blotting檢測結(jié)果顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白Grp78、CHOP表達量較PQ組顯著下降。4結(jié)論(1)PQ通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激激發(fā)線粒體凋亡途徑激發(fā)A549細胞凋亡。(2)PQ通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起A549細胞凋亡。(3)MnTMPyP通過抑制氧化應(yīng)激并緩解線粒體凋亡途徑而減少A549細胞凋亡。(4)MnTMPyP通過抑制氧化應(yīng)激并緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑而減少A549細胞凋亡。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R595.4
【圖文】：

圖 1 各組細胞處理 24 h 后 MTT 法檢測的細胞活性。數(shù)據(jù)以 x±s**P <0.01，PQ 組與對照組比較；##P<0.01，與 PQ 組相比。3.1.2 MnTMPyP 減少 PQ 誘導(dǎo)的 A549 細胞內(nèi) ROS 生成按不同處理因素處理A549細胞24 h后，DCFH-DA法檢測與對照組相比，MnTMPyP組ROS稍增加，但差異無統(tǒng)計學意組ROS顯著增加（P<0.01）；與PQ組相比，PQ+MnTMPyP處理水平顯著降低（P<0.01），表明MnTMPyP預(yù)處理有效減少A成。見圖2。A.

10B.圖2 各組細胞處理24 h后DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)ROS 水平。A.流式細胞儀檢測ROS。B.熒光顯微鏡檢測 ROS 熒光強度(×400)。數(shù)據(jù)以 x±s 表示，獨立重復(fù) 3 次：**P <0.01，PQ組與對照組比較；##P<0.01，與 PQ 組相比。3.1.3 MnTMPyP 降低 PQ 誘導(dǎo)的 A549 細胞內(nèi)的 Ca2+水平對照組和 MnTMPyP 組細胞質(zhì)內(nèi) Ca2+無明顯升高(P>0.05)，與對照組相比，PQ 組 Ca2+水平顯著升高(P<0.01)；與 PQ 組相比，PQ+MnTMPyP 組 Ca2+水平明顯降低(P<0.01)，表明 MnTMPyP 預(yù)處理顯著降低 PQ 處理的細胞內(nèi) Ca2+水平。見圖 3。圖3 各組細胞處理24 h后細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平。數(shù)據(jù)以 x±s表示，獨立重復(fù)3次：**P <0.01

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本文編號：2720440