【摘要】：目的:糖尿病(DM)主要分為兩種類型:I型糖尿病(T1DM)和II型糖尿病(T2DM)。I型糖尿病是一種自身免疫疾病,其病因是由于胰腺β細(xì)胞損傷。II型糖尿病表現(xiàn)為胰島素抵抗導(dǎo)致的血液中胰島素相對(duì)缺乏。近年來有研究表明,II型糖尿病也存在胰島β細(xì)胞凋亡增加導(dǎo)致的β細(xì)胞數(shù)量降低。因此,無論是T1DM還是T2DM,胰島β細(xì)胞功能失調(diào)或缺失都是重要的致病因素,對(duì)這些細(xì)胞的替換或補(bǔ)充已成為糖尿病研究的主要目標(biāo)。雖然諸如胰島移植等治療手段已經(jīng)應(yīng)用于臨床,但是由于供體來源有限,這些方法的應(yīng)用受到很大的制約。近年來干細(xì)胞療法作為一種新興的技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞替代治療。有文獻(xiàn)報(bào)道,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell,bmMSC)在體外能夠誘導(dǎo)成胰島素分泌細(xì)胞,但是其分化機(jī)制的調(diào)控還不是很清楚。轉(zhuǎn)錄激活因子NeuroD/BETA2、MafA、Ngn3、Pdx1等能夠特異性結(jié)合到胰島素啟動(dòng)子300 400 bp范圍內(nèi),協(xié)同調(diào)控胰島素基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過過表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄激活因子分化為胰島素分泌細(xì)胞。但是,這些分化細(xì)胞的胰島素分泌水平并不充足。MafA是轉(zhuǎn)錄因子大Maf家族的一個(gè)成員,作為一個(gè)重要的Insulin 2基因特異性激活因子調(diào)控胰島素基因的表達(dá)。但是有研究表明如果不聯(lián)合NeuroD/BETA2、Ngn3或者Pdx1等激活因子,單一過表達(dá)MafA并不能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為胰島素分泌細(xì)胞。因此我們推測(cè)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在著抑制MafA誘導(dǎo)作用的細(xì)胞因子。在低等動(dòng)物很容易啟動(dòng)再生的過程,隨著生物的進(jìn)化這一過程被抑制,越來越難以啟動(dòng),尋找這些抑制因素必將促進(jìn)再生的過程,但是目前對(duì)于轉(zhuǎn)錄抑制因子了解甚少。在非胰島素分泌細(xì)胞中,如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,其所以沒有向胰島β細(xì)胞分化,也一定存在某種轉(zhuǎn)錄抑制因子,而其可能與抑制胰島素基因的表達(dá),并且抑制再生有關(guān)。因此,發(fā)現(xiàn)和研究這些轉(zhuǎn)錄抑制因子將有助于促進(jìn)干細(xì)胞更好的分化為胰島素分泌細(xì)胞,從而推進(jìn)糖尿病的干細(xì)胞治療應(yīng)用。本研究通過對(duì)小鼠bmMSC和胰島β細(xì)胞系Min6中與胰島素2(Insulin 2,Ins2)基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的核蛋白進(jìn)行比較研究,發(fā)現(xiàn)bmMSC中新的特異結(jié)合蛋白COUP-TFI。COUP-TFs屬于類固醇/甲狀腺素受體超家族,其中有兩個(gè)主要的因子COUP-TFI和COUP-TFII。COUP-TFI在神經(jīng)系統(tǒng),視覺發(fā)育和心臟發(fā)育中都發(fā)揮了重要的作用。它作為重要的調(diào)控因子影響少突膠質(zhì)細(xì)胞,視神經(jīng)前體細(xì)胞以及毛發(fā)細(xì)胞的分化。COUP-TFI能夠直接結(jié)合到DR1序列抑制基因的表達(dá)。小鼠的Ins2基因啟動(dòng)子區(qū)域是否存在DR1序列,以及COUP-TFI是否做為轉(zhuǎn)錄抑制因子,抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化,未見報(bào)道。這可能存在一個(gè)胰島β細(xì)胞分化的新機(jī)制,可能發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的新方法。因此,我們通過抑制bmMSC細(xì)胞中COUP-TFI的表達(dá),同時(shí)過表達(dá)MafA,促進(jìn)bmMSC向胰島素分泌細(xì)胞分化,研究其調(diào)控胰島β細(xì)胞分化的方式及分子機(jī)制。研究應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞對(duì)糖尿病治療的新策略。方法:一、bmMSC中Ins2基因新的結(jié)合蛋白COUP-TFI的研究1、bmMSC和Min6細(xì)胞培養(yǎng)及生物學(xué)特征鑒定。2、通過DNA親和沉淀發(fā)現(xiàn)新的與胰島素啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合蛋白。3、通過RT-PCR和Western Blot檢測(cè)COUP-TFI在Min6和bmMSC細(xì)胞中的表達(dá)。4、通過免疫熒光檢測(cè)COUP-TFI在胰腺組織中的分布。二、沉默bmMSC中COUP-TFI的表達(dá)促進(jìn)bmMSC向胰島素分泌細(xì)胞分化的研究1、通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)COUP-TFI對(duì)Min6細(xì)胞中Ins2表達(dá)的作用。2、通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)COUP-TFI對(duì)Ins2啟動(dòng)子活性的作用。3、通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)siCOUP-TFI對(duì)bmMSC細(xì)胞中Ins2表達(dá)的作用。4、通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)MafA與siCOUP-TFI對(duì)Ins2啟動(dòng)子活性的作用。5、分化細(xì)胞的雙硫腙染色和葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)。6、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分化細(xì)胞的功能。三、轉(zhuǎn)錄抑制因子COUP-TFI調(diào)控Ins2的分子機(jī)制研究1、通過生物信息學(xué)方法尋找小鼠Ins2基因啟動(dòng)子區(qū)與COUP-TFI結(jié)合的位點(diǎn)。2、通過ChIP和EMSA檢測(cè)COUP-TFI的結(jié)合情況。3、通過Co-IP和Ch IP檢測(cè)COUP-TFI是否與NCoR、SMRT及HDAC3形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物。結(jié)果:一、發(fā)現(xiàn)小鼠bmMSC和Min6細(xì)胞中Ins2基因啟動(dòng)子區(qū)差異結(jié)合蛋白COUP-TFI。1、流式細(xì)胞術(shù)分析顯示bmMSC細(xì)胞Sca-1,CD44和CD29表達(dá)陽性;CD117,CD31和CD45表達(dá)陰性,符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。2、bmMSC可以誘導(dǎo)分化成軟骨、骨和脂肪細(xì)胞。具有多潛能性。3、COUP-TFI是Ins2基因啟動(dòng)子新的結(jié)合蛋白。4、COUP-TFI在bmMSC細(xì)胞中表達(dá),但在Min6細(xì)胞中不表達(dá)。5、COUP-TFI廣泛分布在腦組織中,但是在胰腺組織中未發(fā)現(xiàn)陽性染色二、通過沉默bmMSC中COUP-TFI的表達(dá),同時(shí)過表達(dá)MafA,能促進(jìn)bmMSC向胰島素分泌細(xì)胞分化。1、COUP-TFI能降低Ins2啟動(dòng)子區(qū)活性。2、干擾COUP-TFI的同時(shí)過表達(dá)MafA能顯著增強(qiáng)Ins2啟動(dòng)子區(qū)活性。3、干擾COUP-TFI的同時(shí)過表達(dá)MafA使bmMSC表達(dá)胰島內(nèi)分泌細(xì)胞特異性標(biāo)志物,如Ins1,Ins2,Pdx1,Isl-1,Glut2和Pax6,向胰島素分泌細(xì)胞分化。4、分化的細(xì)胞能夠響應(yīng)葡萄糖刺激釋放C肽和胰島素,雙硫腙染色陽性。5、移植分化的細(xì)胞能降低糖尿病小鼠血糖水平。三、COUP-TFI通過與NCoR,SMRT和HDAC3形成復(fù)合物結(jié)合到Insulin 2啟動(dòng)子區(qū)DR-1序列,抑制Insulin 2的表達(dá)1、小鼠Ins2基因啟動(dòng)子區(qū)-53 bp至-40 bp處存在DR1位點(diǎn)。2、ChIP和EMSA發(fā)現(xiàn)COUP-TFI能夠特異結(jié)合在DR1位點(diǎn)。3、ChIP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NCoR、SMRT及HDAC3同樣在該區(qū)域富集4、Co-IP結(jié)果顯示COUP-TFI能夠與NCoR、SMRT及HDAC3形成轉(zhuǎn)錄共抑制復(fù)合物。結(jié)論:COUP-TFI是小鼠Ins2基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合蛋白。其在小鼠bmMSC中表達(dá),在Min6和胰腺組織內(nèi)胰島β細(xì)胞中不表達(dá),可能是Ins2的抑制因子。抑制COUP-TFI協(xié)同過表達(dá)MafA有利于使bmMSC在體外向胰島素分泌細(xì)胞分化。并能顯著降低糖尿病模型小鼠的血糖。COUP-TFI并且通過與NcoR、SMRT和HDAC3形成復(fù)合物特異結(jié)合到DR1位點(diǎn),抑制Ins2基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.1
【圖文】：

圖 1.1 bmMSC 和 Min6 細(xì)胞形態(tài)A：光鏡下培養(yǎng)至第三代的小鼠 bmMSC 呈單層貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)均一，邊界清晰，呈貼壁生長(zhǎng)；B：光鏡下小鼠 Min6 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，成克隆樣集落。比例尺表示 100μm。3.2 bmMSC 的生物學(xué)特征鑒定為了檢測(cè) bmMSC 的純度，我們對(duì)第三代的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果示細(xì)胞 Sca-1，CD44 和 CD29 表達(dá)陽性，CD117，CD31 和 CD45 表達(dá)陰性，符間充質(zhì)干細(xì)胞特征（圖 1.2）。為了檢測(cè) bmMSC 的分化潛能，我們將 bmMSC 分在成軟骨、成骨和成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)，結(jié)果顯示 bmMSC 可以分化成軟（阿爾辛藍(lán)染成藍(lán)色，圖 1.3A），骨（茜素紅染成紅色，圖 1.3 B）和脂肪細(xì)胞（紅染成紅色的脂滴，圖 1.3 C）。不加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的 bmMSC，培養(yǎng)相同時(shí)間為對(duì)照，染色均為陰性（圖 1.3 D，E，F(xiàn)）。以上結(jié)果顯示，我們培養(yǎng)的 bmMS備間充質(zhì)干細(xì)胞的特征，并且具有分化潛能。

圖 1.2 bmMSC 流式細(xì)胞分析流式細(xì)胞儀分析第三代 bmMSC 表面標(biāo)志物 Sca-1，CD44，CD29，CD117，CD31 和 CD45的表達(dá)。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Florian B?hrnsen;Henning Schliephake;;Supportive angiogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells and endothelial cells in monolayer and co-cultures[J];International Journal of Oral Science;2016年04期

2 Shalini Singh;Kauser Usman;Monisha Banerjee;;Pharmacogenetic studies update in type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2016年15期

本文編號(hào)：2719734