【摘要】：目的:糖尿病(DM)主要分為兩種類型:I型糖尿病(T1DM)和II型糖尿病(T2DM)。I型糖尿病是一種自身免疫疾病,其病因是由于胰腺β細胞損傷。II型糖尿病表現(xiàn)為胰島素抵抗導致的血液中胰島素相對缺乏。近年來有研究表明,II型糖尿病也存在胰島β細胞凋亡增加導致的β細胞數(shù)量降低。因此,無論是T1DM還是T2DM,胰島β細胞功能失調或缺失都是重要的致病因素,對這些細胞的替換或補充已成為糖尿病研究的主要目標。雖然諸如胰島移植等治療手段已經(jīng)應用于臨床,但是由于供體來源有限,這些方法的應用受到很大的制約。近年來干細胞療法作為一種新興的技術廣泛應用于細胞替代治療。有文獻報道,骨髓間充質干細胞(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell,bmMSC)在體外能夠誘導成胰島素分泌細胞,但是其分化機制的調控還不是很清楚。轉錄激活因子NeuroD/BETA2、MafA、Ngn3、Pdx1等能夠特異性結合到胰島素啟動子300 400 bp范圍內,協(xié)同調控胰島素基因的轉錄。有研究表明,骨髓間充質干細胞能夠通過過表達這些轉錄激活因子分化為胰島素分泌細胞。但是,這些分化細胞的胰島素分泌水平并不充足。MafA是轉錄因子大Maf家族的一個成員,作為一個重要的Insulin 2基因特異性激活因子調控胰島素基因的表達。但是有研究表明如果不聯(lián)合NeuroD/BETA2、Ngn3或者Pdx1等激活因子,單一過表達MafA并不能促進骨髓間充質干細胞分化成為胰島素分泌細胞。因此我們推測在骨髓間充質干細胞中存在著抑制MafA誘導作用的細胞因子。在低等動物很容易啟動再生的過程,隨著生物的進化這一過程被抑制,越來越難以啟動,尋找這些抑制因素必將促進再生的過程,但是目前對于轉錄抑制因子了解甚少。在非胰島素分泌細胞中,如骨髓間充質干細胞中,其所以沒有向胰島β細胞分化,也一定存在某種轉錄抑制因子,而其可能與抑制胰島素基因的表達,并且抑制再生有關。因此,發(fā)現(xiàn)和研究這些轉錄抑制因子將有助于促進干細胞更好的分化為胰島素分泌細胞,從而推進糖尿病的干細胞治療應用。本研究通過對小鼠bmMSC和胰島β細胞系Min6中與胰島素2(Insulin 2,Ins2)基因啟動子區(qū)結合的核蛋白進行比較研究,發(fā)現(xiàn)bmMSC中新的特異結合蛋白COUP-TFI。COUP-TFs屬于類固醇/甲狀腺素受體超家族,其中有兩個主要的因子COUP-TFI和COUP-TFII。COUP-TFI在神經(jīng)系統(tǒng),視覺發(fā)育和心臟發(fā)育中都發(fā)揮了重要的作用。它作為重要的調控因子影響少突膠質細胞,視神經(jīng)前體細胞以及毛發(fā)細胞的分化。COUP-TFI能夠直接結合到DR1序列抑制基因的表達。小鼠的Ins2基因啟動子區(qū)域是否存在DR1序列,以及COUP-TFI是否做為轉錄抑制因子,抑制骨髓間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化,未見報道。這可能存在一個胰島β細胞分化的新機制,可能發(fā)現(xiàn)誘導骨髓間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化的新方法。因此,我們通過抑制bmMSC細胞中COUP-TFI的表達,同時過表達MafA,促進bmMSC向胰島素分泌細胞分化,研究其調控胰島β細胞分化的方式及分子機制。研究應用骨髓間充質干細胞分化為胰島β細胞對糖尿病治療的新策略。方法:一、bmMSC中Ins2基因新的結合蛋白COUP-TFI的研究1、bmMSC和Min6細胞培養(yǎng)及生物學特征鑒定。2、通過DNA親和沉淀發(fā)現(xiàn)新的與胰島素啟動子區(qū)結合蛋白。3、通過RT-PCR和Western Blot檢測COUP-TFI在Min6和bmMSC細胞中的表達。4、通過免疫熒光檢測COUP-TFI在胰腺組織中的分布。二、沉默bmMSC中COUP-TFI的表達促進bmMSC向胰島素分泌細胞分化的研究1、通過實時熒光定量PCR技術檢測COUP-TFI對Min6細胞中Ins2表達的作用。2、通過雙熒光素酶報告基因檢測COUP-TFI對Ins2啟動子活性的作用。3、通過實時熒光定量PCR技術檢測siCOUP-TFI對bmMSC細胞中Ins2表達的作用。4、通過雙熒光素酶報告基因檢測MafA與siCOUP-TFI對Ins2啟動子活性的作用。5、分化細胞的雙硫腙染色和葡萄糖刺激實驗。6、動物實驗檢測分化細胞的功能。三、轉錄抑制因子COUP-TFI調控Ins2的分子機制研究1、通過生物信息學方法尋找小鼠Ins2基因啟動子區(qū)與COUP-TFI結合的位點。2、通過ChIP和EMSA檢測COUP-TFI的結合情況。3、通過Co-IP和Ch IP檢測COUP-TFI是否與NCoR、SMRT及HDAC3形成轉錄抑制復合物。結果:一、發(fā)現(xiàn)小鼠bmMSC和Min6細胞中Ins2基因啟動子區(qū)差異結合蛋白COUP-TFI。1、流式細胞術分析顯示bmMSC細胞Sca-1,CD44和CD29表達陽性;CD117,CD31和CD45表達陰性,符合骨髓間充質干細胞的特性。2、bmMSC可以誘導分化成軟骨、骨和脂肪細胞。具有多潛能性。3、COUP-TFI是Ins2基因啟動子新的結合蛋白。4、COUP-TFI在bmMSC細胞中表達,但在Min6細胞中不表達。5、COUP-TFI廣泛分布在腦組織中,但是在胰腺組織中未發(fā)現(xiàn)陽性染色二、通過沉默bmMSC中COUP-TFI的表達,同時過表達MafA,能促進bmMSC向胰島素分泌細胞分化。1、COUP-TFI能降低Ins2啟動子區(qū)活性。2、干擾COUP-TFI的同時過表達MafA能顯著增強Ins2啟動子區(qū)活性。3、干擾COUP-TFI的同時過表達MafA使bmMSC表達胰島內分泌細胞特異性標志物,如Ins1,Ins2,Pdx1,Isl-1,Glut2和Pax6,向胰島素分泌細胞分化。4、分化的細胞能夠響應葡萄糖刺激釋放C肽和胰島素,雙硫腙染色陽性。5、移植分化的細胞能降低糖尿病小鼠血糖水平。三、COUP-TFI通過與NCoR,SMRT和HDAC3形成復合物結合到Insulin 2啟動子區(qū)DR-1序列,抑制Insulin 2的表達1、小鼠Ins2基因啟動子區(qū)-53 bp至-40 bp處存在DR1位點。2、ChIP和EMSA發(fā)現(xiàn)COUP-TFI能夠特異結合在DR1位點。3、ChIP檢測發(fā)現(xiàn)NCoR、SMRT及HDAC3同樣在該區(qū)域富集4、Co-IP結果顯示COUP-TFI能夠與NCoR、SMRT及HDAC3形成轉錄共抑制復合物。結論:COUP-TFI是小鼠Ins2基因啟動子區(qū)結合蛋白。其在小鼠bmMSC中表達,在Min6和胰腺組織內胰島β細胞中不表達,可能是Ins2的抑制因子。抑制COUP-TFI協(xié)同過表達MafA有利于使bmMSC在體外向胰島素分泌細胞分化。并能顯著降低糖尿病模型小鼠的血糖。COUP-TFI并且通過與NcoR、SMRT和HDAC3形成復合物特異結合到DR1位點,抑制Ins2基因的表達。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1
【圖文】：

圖 1.1 bmMSC 和 Min6 細胞形態(tài)A：光鏡下培養(yǎng)至第三代的小鼠 bmMSC 呈單層貼壁生長，形態(tài)均一，邊界清晰，呈貼壁生長；B：光鏡下小鼠 Min6 細胞貼壁生長，成克隆樣集落。比例尺表示 100μm。3.2 bmMSC 的生物學特征鑒定為了檢測 bmMSC 的純度，我們對第三代的細胞進行流式細胞術分析，結果示細胞 Sca-1，CD44 和 CD29 表達陽性，CD117，CD31 和 CD45 表達陰性，符間充質干細胞特征（圖 1.2）。為了檢測 bmMSC 的分化潛能，我們將 bmMSC 分在成軟骨、成骨和成脂誘導分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)，結果顯示 bmMSC 可以分化成軟（阿爾辛藍染成藍色，圖 1.3A），骨（茜素紅染成紅色，圖 1.3 B）和脂肪細胞（紅染成紅色的脂滴，圖 1.3 C）。不加誘導分化培養(yǎng)基的 bmMSC，培養(yǎng)相同時間為對照，染色均為陰性（圖 1.3 D，E，F(xiàn)）。以上結果顯示，我們培養(yǎng)的 bmMS備間充質干細胞的特征，并且具有分化潛能。

圖 1.2 bmMSC 流式細胞分析流式細胞儀分析第三代 bmMSC 表面標志物 Sca-1，CD44，CD29，CD117，CD31 和 CD45的表達。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 Florian B?hrnsen;Henning Schliephake;;Supportive angiogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells and endothelial cells in monolayer and co-cultures[J];International Journal of Oral Science;2016年04期

2 Shalini Singh;Kauser Usman;Monisha Banerjee;;Pharmacogenetic studies update in type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2016年15期

本文編號：2719734