【摘要】：背景:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,以慢性滑膜炎為主要病理改變,可以被劃分為ACPA+和ACPA-兩大類,ACPA+的RA患者與特定的HLA II類等位基因相關(guān)。基因突變只能解釋不到20%的ACPA+的RA易感性,對于ACPA-RA貢獻(xiàn)率更低。環(huán)境是重要的誘發(fā)因素�？构习彼峄鞍椎拿庖叻磻�(yīng)早于RA關(guān)節(jié)炎癥狀的出現(xiàn)。在PAD催化下的瓜氨酸化反應(yīng)為ACPA產(chǎn)生提供了抗原,這一反應(yīng)可能在肺、牙齦與腸道發(fā)生,其中肺的作用尤其重要。目的:通過理論研究尋找從肺論治RA的中醫(yī)以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論與實踐依據(jù);通過臨床研究驗證肺損傷在RA發(fā)病中的可能作用;通過動物實驗進(jìn)一步驗證肺損傷是否能夠通過激活PAD酶促進(jìn)瓜氨酸化蛋白的產(chǎn)生進(jìn)而誘發(fā)RA,以及青藤堿是否可以通過抑制PAD酶的活性抑制瓜氨酸化蛋白產(chǎn)生進(jìn)而抑制或減緩RA發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。方法:第一部分理論研究采用文獻(xiàn)綜述的方式,獲取中醫(yī)傳統(tǒng)文獻(xiàn)以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究成果,對從肺論治RA的理論與實踐依據(jù)進(jìn)行綜述分析;第二部分臨床研究采用回顧性研究方法,選取在2014年1月-2017年1月之間因不可解釋的呼吸系統(tǒng)異常接受檢查的符合條件的ACPA陽性個體46例,符合RA分類標(biāo)準(zhǔn),發(fā)病時間小于1年的RA患者24例,以及ACPA陰性對照個體32例,對3組個體進(jìn)行胸部CT的影像學(xué)評估。第三部分動物實驗,將30只雄性DBA/1小鼠隨機分為2組,一組5只作為空白對照組,另一組25只造模,小鼠分別于d0、d 21尾根部注射免疫II膠原乳劑,誘導(dǎo)CIA小鼠模型。選取造模成功的15只在d24天再次隨機分成3組:模型組(n=5);氯脒組(n=5);中藥組(n=5),加上空白對照組(n=5)共4組。d28開始給藥。給藥14天后處死小鼠。主要觀察小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù),滑膜病理改變,肺病理改變,肺PAD-2、PAD-4以及瓜氨酸化蛋白免疫組化、Western Blot蛋白檢測及PAD-2、PAD-4 mRNA表達(dá)。同時觀察Th1相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α,IL-6以及Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4和IL-10的變化。結(jié)果:1、第一部分理論研究結(jié)果,傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)對肺與關(guān)節(jié)之間的關(guān)系認(rèn)識有比較豐富的經(jīng)驗,通過五臟中肺在體合皮,肺主皮毛,肺主氣司呼吸等認(rèn)識,將肺與痹證聯(lián)系起來�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明肺作為RA可能的發(fā)病部位,通過多種觸發(fā)因素(特別是吸煙)導(dǎo)致遺傳易感個體免疫耐受破壞導(dǎo)致RA觸發(fā),這其中PAD酶及其產(chǎn)物瓜氨酸化蛋白是重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2、第二部分臨床研究結(jié)果,無論肺實質(zhì)病變還是氣道異常均呈現(xiàn)ACPA陽性人群大于ACPA陰性對照人群的特點(52%versus 19%肺實質(zhì)病變;52%versus 19%氣道異常;兩者P=0.003)。肺纖維化只發(fā)生于ACPA陽性個體(6[13%]of 46)。肺實質(zhì)病變出現(xiàn)在ACPA陽性和早期RA患者中(52%versus 38%;P=0.243)。兩組出現(xiàn)氣道受累的比例有差別但無統(tǒng)計學(xué)意義(52%versus 67%;P=0.245)�？v隔淋巴結(jié)腫大在ACPA陽性人群中明顯多于ACPA陰性人群(19%versus 0,P=0.033)。3、第三部分動物實驗結(jié)果,d 24至d42,模型組的AI評分較空白組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。初次免疫后d 24至d 42,中藥組的AI評分與模型組比較呈下降趨勢,但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異;d 39至d 39,氯脒組AI評分較模型組顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(d36P0.05,d39P0.01)�？瞻捉M滑膜細(xì)胞約1-2層,分布整齊,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤;模型組滑膜細(xì)胞多呈5-10層排列,可見大量中性粒細(xì)胞和單核淋巴細(xì)胞浸潤;氯脒組和中藥組滑膜細(xì)胞增生改善,炎性細(xì)胞浸潤改善。模型組組血清TNF-α水平較空白組顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與模型組比較,中藥組血清TNF-α水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);模型組血清IL-6水平較空白組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與模型組組比較,氯脒組和中藥組血清IL-6水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。模型組組血清IL-4水平較空白組顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與模型組比較,中藥組血清IL-4水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);模型組血清IL-10水平較空白組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與模型組組比較,氯脒組和中藥組血清IL-10水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。正常肺組織肺泡間隔比較均勻,約2個紅細(xì)胞厚度,結(jié)構(gòu)均勻清晰,肺泡內(nèi)無滲出,偶見淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤在支氣管和血管周圍及肺泡間隔。經(jīng)膠原和佐劑誘導(dǎo)的模型組(見圖7-2)小鼠肺部出現(xiàn)炎癥表現(xiàn),肺泡內(nèi)有漿液性滲出,間質(zhì)性炎癥改變,肺泡內(nèi)有滲出肺泡間隔增寬變厚,結(jié)構(gòu)模糊,在支氣管和血管周圍大量淋巴、巨噬細(xì)胞浸潤。治療組(見圖7-3和圖7-4)肺炎表現(xiàn)減輕,肺泡間隔稍有增寬,淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞少量。與空白組比較,模型組PAD-2、PAD-4和peptidyl-citrulline免疫組化染色明顯增強,灰度值明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(PAD-4的P0.05,PAD-2和peptidyl-citruIline的P0.01);與模型組比較,氯脒組和中藥組PAD-2和peptidyl-citrulline表達(dá)明顯減弱,灰度值明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(中藥組PAD-2的P0.05,其他P0.01);與模型組相比,氯脒組和中藥組的PAD-4均呈下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)差異。與空白組比較,模型組PAD-2、PAD-4和peptidyl-citrulline蛋白表達(dá)明顯增強,相對灰度值明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與模型組比較,氯脒組和中藥組PAD-2、PAD-4和peptidyl-citrulline蛋白表達(dá)表達(dá)明顯減弱,相對灰度值明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。與空白組比較,模型組PAD-2、PAD-4 mRNA表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與模型組比較,氯脒組和中藥組PAD-2、PAD-4 mRNA表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線表明內(nèi)參與目的基因擴(kuò)增效率一致,擴(kuò)增產(chǎn)物單一,實驗結(jié)果可靠。結(jié)論:1、理論研究結(jié)果表明,痹證發(fā)生與肺有密切關(guān)系;肺是RA發(fā)生的一個可能的重要起始部位,肺誘導(dǎo)RA發(fā)生與局部PAD酶及其瓜氨酸化蛋白產(chǎn)物增加有關(guān)。2、臨床研究結(jié)果表明,肺的實質(zhì)病變和氣道異常是一種炎癥狀態(tài),瓜氨酸化蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的ACPA陽性人群中肺部異常人群比例更高,提示肺部炎癥可能是RA的一個可能誘發(fā)因素。3、動物實驗結(jié)果表明,膠原誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠同時存在肺炎與關(guān)節(jié)炎表現(xiàn),通過抑制肺炎局部PAD-2和PAD-4兩種酶的產(chǎn)生可以減輕小鼠模型的關(guān)節(jié)炎癥狀并減輕肺炎表現(xiàn),同時降低Th1相關(guān)炎癥細(xì)胞因子分泌,升高Th2相關(guān)細(xì)胞因子分泌。青藤堿可能通過抑制PAD-2和PAD-4酶進(jìn)而抑制肺炎局部瓜氨酸化蛋白的產(chǎn)生,從而減輕模型小鼠關(guān)節(jié)炎癥,發(fā)揮治療作用。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.22
【圖文】：

南京中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文．１邋／－邐—＊—逡逑刖邋Ｓ逡逑類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ邋ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）是一種自身免疫性疾病，以慢性滑膜要病理改變，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛腫脹、關(guān)節(jié)損傷和活動受限，最終會導(dǎo)致關(guān)節(jié)殘疾。一項關(guān)于中低收入國家ＲＡ患病率的研究顯示，男性ＲＡ的患病率為０．１６％（９０．１１－０．２０％），女性達(dá)到邋０．７５％（９５％ＣＩ：０．６０－０．９０％）ｍ。以抗瓜氨酸化抗體（ＡＣＰＡ陽性來劃分，ＲＡ可以被劃分為ＡＣＰＡ＋和ＡＣＰＡ－兩大類［２］。ＡＣＰＡ＋的ＲＡ患者與ＨＬＡ邋ＩＩ類等位基因相關(guān)。多項全基因組關(guān)聯(lián)分析（ＧＷＡＳ）己經(jīng)確認(rèn)遺傳變異群體中均與ＲＡ發(fā)病相關(guān)聯(lián)。但是，這些突變只能解釋不到２０％的ＡＣＰＡ＋的Ｒ性，對于ＡＣＰＡ－ＲＡ貢獻(xiàn)率更低。環(huán)境誘發(fā)因素是重要的環(huán)境風(fēng)險因素，在ＲＡ至關(guān)重要［３］。逡逑

圖２：瓜氨酸化蛋白在ＲＡ發(fā)病中的作用逡逑Ｆｉｇ邋２：邋Ｔｈｅ邋Ｒｏｌｅ邋ｏｆ邋Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｉｎ邋Ｔｈｅ邋Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＲＡ逡逑觸發(fā)因素可能主要與環(huán)境暴露有關(guān)。已知吸煙、硅塵、有機溶劑均與ＡＣＰＡ陽患者密切相關(guān)［４］。環(huán)境暴露和ＨＬＡ突變相互作用，共同導(dǎo)致ＲＡ發(fā)生。通過遺傳學(xué)研究，在肺和齒齦發(fā)現(xiàn)了被瓜氨酸化的轉(zhuǎn)錄后修飾蛋白，可能是自身免疫的重發(fā)因素。吸煙和其他因素可能觸發(fā)瓜氨酸化（通過肽基精氨酸轉(zhuǎn)亞胺基酶，ＰＡＤｓ）生一系列自身抗原＆６］，進(jìn)而誘導(dǎo)類淋巴組織形成，增強抗原呈遞和Ｔ、Ｂ淋巴細(xì)胞。免疫系統(tǒng)如何對抗瓜氨酸化蛋白，又如何與其他免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，比如ＲＦ的產(chǎn)生甲酰自身抗體的產(chǎn)生等等，以及為什么主要影響關(guān)節(jié)，都需要進(jìn)一步研究。有不究發(fā)現(xiàn)攜帶ＡＣＰＡ的正常人常年沒有發(fā)展成ＲＡｍ。在什么條件下ＡＣＰＡ可以觸發(fā)ＲＡ些人可能發(fā)展成為ＲＡ。這些問題可能與人體天然免疫和適應(yīng)性免疫有關(guān)。ＨＬＡ相免疫對瓜氨酸化和其他轉(zhuǎn)錄后修飾抗原在其中發(fā)揮重要作用。逡逑在血液中檢測到ＲＡ［８］相關(guān)抗體要早于關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［９］，并且與粘膜損傷密切相

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2717216