【摘要】：背景和目的糖尿病是臨床最常見的慢性代謝性內(nèi)分泌病。隨著改革開放后社會(huì)的飛速發(fā)展和人民群眾物質(zhì)文化需求的改變,糖尿病人越來越多,其發(fā)病率也是逐年增長,臨床工作中發(fā)現(xiàn)在糖尿病各型病人中,2型糖尿病患者數(shù)量最多,而且發(fā)病年齡趨向于年輕化。在生活水平提高的同時(shí),糖尿病患者對生活質(zhì)量和審美的要求也越來越高,因此,國內(nèi)糖尿病患者的牙齒正畸需求日趨旺盛,而異常的高糖(high glucose,HG)狀態(tài)和晚期糖基化終末產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致全身骨代謝紊亂,破壞牙槽骨骨代謝的平衡,嚴(yán)重影響了正畸的療效,這已經(jīng)成為臨床正畸治療亟待解決的問題之一。與其它骨骼一樣,牙槽骨的穩(wěn)態(tài)也是通過骨吸收和骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡來維持。正畸牙齒移動(dòng)依靠機(jī)械力引起的牙槽骨改建,受壓力側(cè)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)引起牙槽骨吸收,受張力側(cè)成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)形成新骨。牙齒受到機(jī)械力的刺激后便會(huì)激活牙槽骨的重建。近來研究表明,骨細(xì)胞是早期機(jī)械性骨重建的主要靶點(diǎn)。骨細(xì)胞是骨組織中最豐富的細(xì)胞,具有細(xì)胞突起,突起間的間隙連接將多個(gè)骨細(xì)胞連接在一起,構(gòu)成星網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使細(xì)胞信號(hào)可以在多個(gè)細(xì)胞間傳遞,使代謝產(chǎn)物在此通道內(nèi)交流和互換。骨細(xì)胞在體內(nèi)的受力形式為外界應(yīng)力作用于骨,刺激骨陷窩小管中的組織液流動(dòng),產(chǎn)生作用于骨細(xì)胞的流體剪切應(yīng)力。大量實(shí)驗(yàn)亦證明,在體外環(huán)境中,骨細(xì)胞較為敏感的力學(xué)刺激信號(hào)是流體剪切應(yīng)力。骨細(xì)胞作為機(jī)械感受細(xì)胞,感受外界應(yīng)力刺激,并將生物力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)傳遞給其他骨組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等來控制骨吸收和骨形成,是整個(gè)牙槽骨代謝的重要調(diào)控者。二甲雙胍(Metformin,MF)是目前臨床上治療2型糖尿病的一線藥物,降糖作用顯著。近來研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍除了降糖作用以外,還具有很多作用,尤其是二甲雙胍對骨的直接保護(hù)作用成為研究的熱點(diǎn)。但是,目前關(guān)于糖尿病對正畸牙移動(dòng)的不利影響,以及二甲雙胍對骨代謝有何作用的研究報(bào)道大都集中在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上,而二者對于骨細(xì)胞的影響則鮮見報(bào)道。鑒于骨細(xì)胞在調(diào)控骨改建過程中的重要作用,在本實(shí)驗(yàn)中,我們在體外建立流體剪切應(yīng)力施加模型,運(yùn)用小鼠骨樣細(xì)胞系MLO-Y4作為研究對象,研究在流體剪切應(yīng)力下,高糖對骨樣細(xì)胞MLO-Y4的影響,二甲雙胍干預(yù)對高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞的作用以及高糖處理和二甲雙胍處理的骨樣細(xì)胞上清液對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生何種誘導(dǎo)效應(yīng);在體內(nèi)建立大鼠2型糖尿病正畸牙齒移動(dòng)模型,施加二甲雙胍,研究二甲雙胍在2型糖尿病大鼠牙移動(dòng)過程中對骨細(xì)胞及骨改建的作用,并從組織學(xué)的角度尋找二甲雙胍影響牙槽骨骨細(xì)胞的證據(jù)�？傊�,本課題通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究二甲雙胍在流體剪切應(yīng)力和高糖環(huán)境下對骨細(xì)胞的影響及機(jī)制,從骨代謝重要調(diào)控者--骨細(xì)胞的角度,為臨床糖尿病正畸患者提供治療思路和有力的理論依據(jù)。材料與方法1.流體剪切應(yīng)力下,高糖對骨樣細(xì)胞MLO-Y4的影響在施加流體剪切力的基礎(chǔ)上,以不同濃度葡萄糖(5.5、11、22、33、44、66mM)干預(yù)骨樣細(xì)胞MLO-Y4,葡萄糖(5.5 mM)為對照組,應(yīng)用細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡率;細(xì)胞免疫熒光技術(shù)測施加流體剪切應(yīng)力對MLO-Y4細(xì)胞的影響;礦化誘導(dǎo)測不同葡萄糖濃度下骨樣細(xì)胞的礦化情況;qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測各標(biāo)志物mRNA和蛋白的變化。2.流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍對高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞的作用以及高糖處理和二甲雙胍處理骨樣細(xì)胞上清液對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響2.1流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍對高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞MLO-Y4的作用在施加流體剪切力的基礎(chǔ)上,將骨樣細(xì)胞進(jìn)行兩種不同的處理:1)使用HG22mM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后,添加不同濃度的二甲雙胍,繼續(xù)培養(yǎng);2)使用HG22mM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后,更換為普通培養(yǎng)基,并添加不同濃度的二甲雙胍,繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置葡萄糖(5.5 mM)復(fù)合二甲雙胍(0μM)為對照組,應(yīng)用細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡率;礦化誘導(dǎo)檢測不同葡萄糖濃度下骨樣細(xì)胞的礦化情況;qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測各標(biāo)志物mRNA和蛋白的變化。2.2高糖處理和二甲雙胍處理骨樣細(xì)胞MLO-Y4上清液對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響收集上述不同處理的骨樣細(xì)胞培養(yǎng)上清液,培養(yǎng)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測不同處理的骨樣細(xì)胞培養(yǎng)上清液對成骨細(xì)胞凋亡的影響;礦化誘導(dǎo)測成骨細(xì)胞的礦化能力;qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測各成骨相關(guān)標(biāo)志物mRNA和蛋白的變化。使用小鼠RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞,并在誘導(dǎo)過程中施加不同處理的骨樣細(xì)胞培養(yǎng)上清液,觀察其對破骨細(xì)胞形成數(shù)目和功能的影響。3.流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍調(diào)控高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞MLO-Y4的機(jī)制初探3.1生物信息學(xué)分析通過DrugBank數(shù)據(jù)庫,找到二甲雙胍的作用靶點(diǎn),然后,通過String數(shù)據(jù)庫,找到10個(gè)與二甲雙胍的作用靶點(diǎn)PRKAB1密切相關(guān)的基因,然后通過KEGG數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫和上述基因來預(yù)測二甲雙胍參與調(diào)控的生物學(xué)過程和影響到的信號(hào)通路。3.2 Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測流體剪切應(yīng)力下,高糖培養(yǎng)基(HG22mM)培養(yǎng)骨樣細(xì)胞14d,更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,之后添加1M二甲雙胍,在Omin,5min,15min,30min,60min,90 min,2h-10h,收集細(xì)胞蛋白,Western blot技術(shù)檢測不同信號(hào)通路隨時(shí)間點(diǎn)的變化。4.流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍調(diào)控高糖致?lián)p骨細(xì)胞的體內(nèi)研究購買SPF級Wistar大鼠并建立2型糖尿病大鼠模型,設(shè)置上頜第一磨牙近中移動(dòng)加力裝置,一組經(jīng)胃灌注給予100mg/kg/day的二甲雙胍(二甲雙胍組),另一組給予同量生理鹽水作為對照(糖尿病組);正常大鼠復(fù)合正畸組作為空白對照(正常組)。每周稱量體重,同時(shí)檢測血糖水平,正畸2周后麻醉,口內(nèi)取模測量牙齒移動(dòng)距離,4%多聚甲醛心臟灌注法處死動(dòng)物,取上頜骨行固定、脫鈣、制作石蠟切片,伊紅-蘇木素(HE)染色觀察牙槽骨組織形態(tài)的變化;抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)復(fù)合堿性磷酸酶(ALP)雙重染色,觀察破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的變化;免疫組織化學(xué)染色觀察骨細(xì)胞標(biāo)志物硬骨素(sclerostin,SOST),牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(dental matrix protein-1,DMP-1)的表達(dá)變化。結(jié)果1.流體剪切應(yīng)力下,高糖對骨樣細(xì)胞MLO-Y4的影響1)細(xì)胞免疫熒光顯示:流體剪切應(yīng)力施加組,F-actin蛋白亮度明顯增加,細(xì)胞突觸增長;2)CCK-8法檢測細(xì)胞增殖和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果顯示:MLO-Y4細(xì)胞在葡萄糖作用3天后,11、22mM葡萄糖組,呈劑量依賴式促進(jìn)細(xì)胞增殖(p0.05),降低細(xì)胞凋亡率(P0.05)。而33、44、66mM葡萄糖組抑制細(xì)胞增殖(P0.05),促進(jìn)細(xì)胞的凋亡(p0.05),66mM組促凋亡作用最為明顯(P0.01);3)礦化誘導(dǎo)結(jié)果顯示:隨著葡萄糖濃度的增高,礦化結(jié)節(jié)形成減少,鈣含量呈劑量依賴式降低(p0.05);4)qRT-PCR和WB結(jié)果顯示:隨著葡萄糖濃度(5.5-66mM)的升高,OPN,OCN,DMP-1的表達(dá)呈劑量依賴式遞減;SOST的表達(dá)和RANKL/OPG的比值呈劑量依賴式遞增。2.流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍對高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞的作用以及高糖處理和二甲雙胍處理骨樣細(xì)胞上清液對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響2.1流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍對高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞MLO-Y4的作用2.1.1在流體剪切應(yīng)力和高糖環(huán)境下,添加不同濃度的二甲雙胍(MF0-800μM)1)CCK-8檢測增殖活性和流式細(xì)胞儀檢測凋亡率,結(jié)果顯示:不同濃度的MF(100-800μM),均可促進(jìn)MLO-Y4細(xì)胞的增殖,降低其凋亡率,峰值出現(xiàn)在MF400μM。2)礦化誘導(dǎo)結(jié)果顯示:不同濃度的MF(100-800μM),均能促進(jìn)MLO-Y4細(xì)胞的礦化,以MF100μM濃度的作用最為明顯。3)qRT-PCR結(jié)果顯示:在MF 100-2000μM范圍內(nèi),OCNmRNA,OPNmRNA的表達(dá)增高,在 MF 100μM 時(shí)達(dá)到峰值;在添加 MF 400-800μM 時(shí),OCNmRNA,OPNmRNA的表達(dá)降低,MF800μM下降的幅度較大;在MF100-800μM范圍內(nèi),DMP-1mRNA的表達(dá)呈劑量依賴式增高,SOSTmRNA的表達(dá)呈劑量依賴式降低;RANKL/OPGmRNA的比值呈劑量依賴式下降。4)WB結(jié)果顯示:低濃度MF 100-200μM,可以在一定程度上緩解高糖對OCN、OPG、DMP-1的抑制作用,高濃度MF 400-800μM,緩解作用明顯。同時(shí),低濃度MF 100-200μM可以在一定程度上降低高糖對SOST,RANKL的促進(jìn)作用,高濃度MF 400-800μM作用更明顯。2.1.2在流體剪切應(yīng)力和高糖環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞14天后,更換普通培養(yǎng)基,并添加二甲雙胍(MF0-800μM)1)MF0-400μM,均能促進(jìn)細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞凋亡率,峰值出現(xiàn)在MF 100μM,而添加MF800μM會(huì)抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。2)礦化誘導(dǎo)結(jié)果顯示:不同濃度MF0-800μM,均能明顯的促進(jìn)骨樣細(xì)胞MLO-Y4的礦化,MF2000μM濃度作用最為明顯。3)在MF100-800μM范圍內(nèi),OCNmRNA、OPNmRNA的表達(dá)均增加,在添加MF200μM時(shí)OCNmRNA、OPNmRNA的表達(dá)達(dá)到峰值;在MF 100-800 μM范圍內(nèi),DMP-1mRNA表達(dá)增高,SOSTmRNA表達(dá)降低;在施加MF400μM時(shí),DMP-1mRNA表達(dá)量最高,SOSTmRNA表達(dá)量最低;RANKL/OPGmRNA的比值呈劑量依賴式下降。4)WB結(jié)果顯示:相比對照組,添加二甲雙胍組別能明顯的促進(jìn)骨樣細(xì)胞MLO-Y4中OCN、OPG、DMP-1蛋白的表達(dá),降低RANKL和SOST蛋白的表達(dá)。2.2高糖處理和二甲雙胍處理骨樣細(xì)胞MLO-Y4上清液對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響2.2.1高糖處理和二甲雙胍處理骨樣細(xì)胞MLO-Y4上清液對成骨細(xì)胞的影響1)流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示:在按1:1比例添加正常成骨細(xì)胞培養(yǎng)液加各種不同處理骨樣細(xì)胞上清液后,高糖骨樣細(xì)胞上清液和高糖加MF 200μM組凋亡率增高,高糖更換普通培養(yǎng)基并添加二甲雙胍組,凋亡率降低。2)礦化誘導(dǎo)結(jié)果:高糖骨樣細(xì)胞上清液處理組,礦化結(jié)節(jié)形成的最少,高糖加二甲雙胍組較高糖組增多,但是對比正常對照組和單純二甲雙胍處理組仍較低。而高糖更換普通培養(yǎng)液并添加二甲雙胍組,礦化結(jié)節(jié)呈劑量依賴式增多。3)qRT-PCR和Western結(jié)果顯示:高糖骨樣細(xì)胞上清液組中COL I、OPG和OCN表達(dá)明顯降低,高糖加MF200μM組中上述因子的表達(dá)有所提升,但相比正常對照組和單純MF處理組仍較低;而在高糖更換普通培養(yǎng)基并加二甲雙胍組COL-I呈劑量依賴式增加;OPG、OCN在MF200-400μM范圍內(nèi)呈劑量依賴式增加。RANKL在高糖骨樣細(xì)胞上清液組和高糖加200μM二甲雙胍組均表達(dá)較高,在高糖更換普通培養(yǎng)基并加MF組,RANKL表達(dá)呈劑量依賴式降低。2.2.2高糖處理和二甲雙胍處理骨樣細(xì)胞MLO-Y4上清液對破骨細(xì)胞的影響1)破骨細(xì)胞數(shù)目:高糖處理骨樣細(xì)胞上清液能明顯促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成,破骨細(xì)胞形成多且面積較大;高糖復(fù)合MF處理骨樣細(xì)胞上清液能改善高糖對破骨細(xì)胞生成的影響,降低破骨細(xì)胞的數(shù)量和面積;高糖更換普通培養(yǎng)基后再添加MF組,呈劑量依賴式抑制破骨細(xì)胞的形成。2)破骨細(xì)胞功能:高糖處理骨樣細(xì)胞上清液組,破骨細(xì)胞功能活躍,形成的骨陷窩面積最大;高糖復(fù)合MF骨樣細(xì)胞上清液組,破骨細(xì)胞的功能較高糖組減弱;高糖更換普通培養(yǎng)基后再添加MF組,破骨細(xì)胞形成的陷窩面積呈劑量依賴式減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍調(diào)控高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞MLO-Y4的機(jī)制初探3.1.生物信息分析1)通過Drugbank數(shù)據(jù)庫,查詢到二甲雙胍的作用靶點(diǎn)為5'-AMP-activated protein kinase subunit beta-1,基因名為 PRKAB1。通過 String 數(shù)據(jù)庫中查詢到 10 個(gè)與 PRKAB1 密切相關(guān)的基因:PRKAG1、PRKAA2、PRKAA1、PRKAG2、PRKAG3、STK11、ULK1、ACACA、TP53、MTOR;2)通過 KEGG 數(shù)據(jù)庫檢索到二甲雙胍涉及的信號(hào)通路主要有:AMPK、mTOR、Adipocytokine、Insulin、Regulation of autophagy、Glucagon、Insulin resistance、Circadian rhythm、Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)、Oxytocin 信號(hào)通路。其中,與二甲雙胍關(guān)系最為密切的信號(hào)通路是AMPK信號(hào)通路(pValue:1.03E-31);3)通過GO數(shù)據(jù)庫,檢索到二甲雙胍涉及的生物學(xué)進(jìn)程主要有細(xì)胞周期停滯、蛋白磷酸化、大自噬、p53類調(diào)控因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、脂肪酸生物合成進(jìn)程、基因表達(dá)正向調(diào)控、營養(yǎng)水平的細(xì)胞反應(yīng)、自噬的正向調(diào)控、肉堿穿梭、前列腺素E激活的細(xì)胞反應(yīng)等密切相關(guān)。3.2.Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測在二甲雙胍作用于高糖致?lián)p的骨樣細(xì)胞后,p-Ampk,p-Erk,和p-Jnk的表達(dá)量隨時(shí)間變化(5min-10h)呈現(xiàn)出表達(dá)升高-降低等周期性的變化。p38和NF-κB信號(hào)通路中的p-p65在檢測的時(shí)間段(5min-10h)未見表達(dá)的改變。4.流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍調(diào)控高糖致?lián)p骨細(xì)胞的體內(nèi)研究1)2型糖尿病大鼠正畸牙齒模型成功建立,血糖值明顯高于正常對照組(p0.05),二甲雙胍用藥組血糖值與正常組無明顯差異(p0.05);2)二甲雙胍組較糖尿病組牙齒移動(dòng)距離減少(p0.05),與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);3)二甲雙胍組與糖尿病組相比,破骨細(xì)胞減少,ALP表達(dá)增強(qiáng)(p0.05),與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);4)免疫組織化學(xué)染色顯示,二甲雙胍組相較于糖尿病組,骨細(xì)胞中SOST陽性骨細(xì)胞所占比值減少,而DMP-1陽性骨細(xì)胞所占比值增加(p0.05),上述因子表達(dá)與正常組比較無明顯差異(p0.05)。結(jié)論1.流體剪切應(yīng)力下,低濃度高糖(11mM-22mM)可以促進(jìn)骨樣細(xì)胞的增殖和活性,高濃度高糖(33mM-66mM)則抑制骨樣細(xì)胞的增殖和活性,促進(jìn)其凋亡;隨著葡萄糖濃度的增高(1 1mM-66mM),正向調(diào)控礦化相關(guān)因子OPN,OCN,DMP-1的表達(dá)呈劑量依賴式遞減,負(fù)向調(diào)控礦化因子SOST的表達(dá)和RANKL/OPG的比值呈劑量依賴式遞增,骨樣細(xì)胞礦化能力減弱。2.流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍可以改善高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞的增殖活性和功能,使高糖誘導(dǎo)表達(dá)升高的SOST表達(dá)下調(diào),表達(dá)降低的DMP-1表達(dá)上調(diào),進(jìn)而影響骨樣細(xì)胞對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的調(diào)控功能,增加骨形成能力和降低骨吸收能力。同時(shí),在流體剪切應(yīng)力下,二甲雙胍在高糖環(huán)境中,需要一定的濃度來改善高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞的活性和對成骨破骨的調(diào)控功能;而在正常葡萄糖環(huán)境中,二甲雙胍則可以較好地逆轉(zhuǎn)高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞的活性和對成骨破骨的調(diào)控功能。3.流體剪切應(yīng)力作用下,AMPK、ERK、JNK信號(hào)通路參與了二甲雙胍對高糖致?lián)p骨樣細(xì)胞的調(diào)控。而p38信號(hào)通路,NF-κB信號(hào)通路(p65)未參與該調(diào)控過程。4.糖尿病使骨細(xì)胞高表達(dá)SOST,低表達(dá)DMP-1,增強(qiáng)了正畸力作用下破骨細(xì)胞的數(shù)目和活性,損傷了成骨細(xì)胞的功能,導(dǎo)致了牙齒移動(dòng)距離加大。應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)后,二甲雙胍逆轉(zhuǎn)了糖尿病對骨細(xì)胞的損害,使SOST和DMP-1的表達(dá)趨于正常化,降低了破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性,并在一定程度上改善了成骨細(xì)胞活性,促使牙齒移動(dòng)正�；�。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.1;R783.5
【圖文】：

圖１－１：邋ＭＬ０－Ｙ４細(xì)胞的Ｆ－ａｃｔｉｎ細(xì)胞免疫熒光染色（ＭＯＯ）。Ａ－Ｃ：流體剪切逡逑應(yīng)力施加組；Ｂ－Ｄ：正常培養(yǎng)組。Ａ，邋Ｄ：邋Ｆ－ａｃｔｉｎ陽性（綠色）；Ｂ，邋Ｅ：核染逡逑色（Ｄａｐｉ，藍(lán)色）；Ｃ，邋Ｆ：兩通道組合圖像。逡逑

Ｉ逡逑ＨＢＢＣＩＢＢＨＩＨＢＣＢ逡逑圖１－１：邋ＭＬ０－Ｙ４細(xì)胞的Ｆ－ａｃｔｉｎ細(xì)胞免疫熒光染色（ＭＯＯ）。Ａ－Ｃ：流體剪切逡逑應(yīng)力施加組；Ｂ－Ｄ：正常培養(yǎng)組。Ａ，邋Ｄ：邋Ｆ－ａｃｔｉｎ陽性（綠色）；Ｂ，邋Ｅ：核染逡逑色（Ｄａｐｉ，藍(lán)色）；Ｃ，邋Ｆ：兩通道組合圖像。逡逑２．邐ＣＣＫ－８法測細(xì)胞增殖結(jié)果逡逑收集葡萄糖作用３天后的ＭＬ０－Ｙ４細(xì)胞株，ＣＣＫ－８法檢測結(jié)果顯示：１１、２２逡逑ｍＭ葡萄糖組呈劑量依賴式促進(jìn)細(xì)胞X椫常ǎ穡跡埃埃擔(dān)玻玻恚推咸煙親櫬僭鮒匙饔酶義廈饗

本文編號(hào)：2715502