【摘要】：研究背景和目的:衰老作為一個全身性的事件,不僅以孤立的方式影響著某個組織或器官,其對骨骼系統也產生不利的影響。骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種骨量減低,骨結構破壞導致骨脆性增加因而易發(fā)生骨折的全身性疾病。原發(fā)性骨質疏松癥包括絕經后骨質疏松癥、老年骨質疏松癥和特發(fā)性骨質疏松癥。和衰老相關的骨質疏松癥主要指老年性骨質疏松癥。抗衰老治療能夠增加小鼠骨小梁量及骨組織生物機械特性,因此,我們有理由相信,抗衰老是治療老年性骨質疏松癥的一種有效方法。長久以來,人們一直在研究延緩衰老以達到長生不老的方法。有研究報道:年輕個體的血液、血漿及他們的衍生物能夠促進干細胞功能及組織的再生和修復,因此其能夠對抗衰老過程。而通過聯體共生/血漿注射實現兩只動物的血液交換對于衰老/抗衰老的研究具有十分重要的作用。研究表明,異時聯體共生/年輕血漿注射能夠對抗衰老的不利影響,對于對抗老年性骨質疏松癥具有積極的作用;反之,異時聯體共生/老年血漿注射能夠對年輕動物的組織產生不利的影響。因此,我們推測,在動物體內是否存在某種/某些關鍵的因子,其隨著年齡的增長而改變,通過調節(jié)這種或這些因子能夠影響骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展進程。本課題旨在探討老年血漿是否能夠影響小鼠的骨骼“衰老”,進一步研究其中關鍵的分子及其對于骨質疏松癥的意義。研究方法:本研究分三部分進行:第一部分觀察異時聯體共生/老年血漿注射對年輕小鼠的骨量影響。聯體共生實驗共分為三個組,分別為年輕小鼠與年輕小鼠共生組,年輕小鼠與老年小鼠共生組,假共生組,在共生模型建立后4周,于一只小鼠尾靜脈注射Evan染液,通過觀察Evan染液向與其共生小鼠滲透情況,確認聯體共生模型是否成功;共生后正常飼養(yǎng)3個月。血漿注射實驗分為三個組,分別為注射年輕血漿組,注射老年血漿組,注射生理鹽水組,提取18月老年雄性及3月年輕雄性C57小鼠血液、常規(guī)離心后收集血漿,將血漿對3月齡年輕C57小鼠進行尾靜脈注射,每周2次,每次0.2 ml,共注射8周,另外設置一組即對3月齡年輕C57小鼠尾靜脈注射生理鹽水,每周2次,每次0.2 ml。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法觀察幾組動物模型中小鼠的骨量丟失及成骨和破骨情況。第二部分篩選影響骨質丟失的關鍵分子。通過定制蛋白芯片分析聯體共生/老年血漿注射兩種模型,分別篩選各自的關鍵分子,交叉得到CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5四種關鍵分子。然后進行驗證實驗,實驗分為五組:注射老年血漿組、注射老年血漿+CCL11抗體組、注射老年血漿+CXCL1抗體組、注射老年血漿+IL-13抗體組、注射老年血漿+CCL5抗體組,每周注射2次,每次0.2 ml老年血漿,抗體注入時,每周1次,每次0.1 ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色的方法觀察幾組動物模型中小鼠的骨量丟失的情況。最后得出CCL11效果最強的初步結論。第三部分探討CCL11與年輕和老年小鼠骨量丟失的關系。本實驗分為六組:年輕小鼠組、年輕小鼠注射CCL11組、年輕小鼠注射CCL11+CCL11抗體組、老年小鼠組、老年小鼠注射CCL11組、老年小鼠注射CCL11+CCL11抗體組,每周2次,每次0.1 ml CCL11重構體,CCL11抗體注入時,每周2次,每次0.1 ml,共注射8周。用MICROCT、HE染色、TRAP染色和VONCOSSA染色等方法觀察幾組動物模型中小鼠的骨量丟失及成骨和破骨情況。結果:第一部分:在聯體共生模型中,年輕與老年小鼠共生組年輕小鼠在BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.area上明顯低于其余兩組(年輕小鼠與年輕小鼠共生組,假共生組);N.ob/B.Pm及P1NP(骨形成指標)較其余兩組減低;N.Oc/B.Pm及CTX(骨吸收指標)較其余兩組增高。在血漿注射模型中我們觀察到注射老年血漿的年輕小鼠在BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area上明顯低于其余兩組(注射年輕血漿的年輕小鼠,注射生理鹽水的年輕小鼠),且N.ob/B.Pm及P1NP較其余兩組減低,而N.Oc/B.Pm及CTX較其余兩組增高。這些結果提示:老年血液和血漿確實可加速小鼠骨質和骨量的丟失。第二部分:我們發(fā)現,注射老年血漿+CCL11抗體的年輕小鼠BMD、BV\TV、Tb.N、Tb.area比注射老年血漿組明顯增高;而注射老年血漿+CXCL1抗體組、注射老年血漿+IL-13抗體組、注射老年血漿+CCL5抗體組比注射老年血漿組在上述指標上無明顯差異。結果提示:CCL11可能是老年血漿可以加速年輕小鼠骨質和骨量丟失的關鍵。第三部分:我們發(fā)現,對于年輕小鼠來說,CCL11注射組在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area較年輕小鼠組和年輕小鼠注射CCL11+CCL11抗體組兩組均明顯減低,N.ob/B.Pm、P1NP均明顯減低,而N.Oc/B.Pm,CTX指標明顯增高;同樣對于老年小鼠,CCL11注射組較其余兩組(老年小鼠組和老年小鼠注射CCL11+CCL11抗體組)在BMD、BV/TV、Tb/N、Tb.area明顯減低,在N.ob/B.Pm、P1NP明顯減低,而在N.Oc/B.Pm和CTX上,三組間無明顯差異。結果提示:CCL11確實可以加速年輕和老年小鼠的骨質和骨量的丟失,成骨細胞功能下降可能是關鍵原因之一。結論:1、在異時聯體共生模型中,年輕小鼠和同種屬老年小鼠共生后,導致年輕小鼠骨量丟失;在血漿注射模型中,對年輕小鼠注射老年血漿后促進年輕小鼠的骨量丟失。2、在聯體共生模型和血漿注射模型中共同升高的因子為CCL11、CXCL1、IL-13、CCL5;而其中CCL11為影響骨量丟失的關鍵因子。3、CCL11注射后能引起年輕小鼠和老年小鼠的骨量丟失,且CCL11被CCL11抗體抑制后這種加速骨量丟失的效應消失�？傊�,老年血漿能夠加速年輕小鼠的骨量丟失,這種作用可能是通過血漿中高濃度的CCL11實現的。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R580
【圖文】：

2-14 周）血漿，方法簡述如下：使用左手將待采血小鼠固定后，右手精棉球對小鼠眶周皮膚消毒 2 次，消毒完畢后，左手拇指與食指輕壓使小鼠眶后靜脈叢充血，右手持內徑 0.5 mm 的玻璃毛細管自眼內眥刺約 2-3 mm，當遇到阻力時，停止，同時，緩慢將針退出約 0.1-0.5 mm毛細管使出血順暢。血液采集完成后，將所采集血液置于含有抗凝劑（中，放于溫箱中 37 ℃ 靜置半個小時，使用離心機 5000 rpm， 離心 1清液，將上清液置于 -80 ℃ 冰箱中冷凍保存。采取尾靜脈注射的方式將 C57 小鼠尾靜脈置于 50 ℃ 水中浸潤 20 秒鐘后，將其固定在小鼠用食指和中指于小鼠尾巴近端稍用力加壓，而用拇指和環(huán)指于小鼠尾巴定，使用酒精棉球自小鼠尾巴近端向遠端環(huán)狀加壓涂抹 2 次，將小鼠鼠尾的末端，右手持 1 ml 注射器使針頭方向與鼠尾巴方向平行順血管針洞朝上緩慢推進，當看到回血后，注射）分別對 B1、 B2、 B3 組鹽水、老年血漿、年輕血漿 8 周，每周 2 次，每次 0.2 ml； 注射全月，處死小鼠取股骨送檢。

圖 2 共生模型 MICROCT 和 HE 染色骨參數分析結果注射實驗中， B2 組年輕小鼠（對年輕小鼠注射老年血漿）較射生理鹽水）B3 組（對年輕小鼠注射年輕血漿）BMD、BV/減低（圖 3 ）。

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1 王曉冰;;年輕血液真能抗衰老嗎?[J];百科知識;2017年01期

2 張善o

本文編號：2713734