【摘要】：目的:胸腺是產生自我限制和自身耐受的功能性T淋巴細胞的主要淋巴器官。來自骨髓的淋巴造血祖細胞在此分化發(fā)育成成熟的T淋巴細胞。為了維持能夠支持胸腺細胞正常分化的微環(huán)境,需要胸腺細胞和胸腺微環(huán)境之間復雜的相互作用。研究表明胸腺基質微環(huán)境的破壞在胸腺增齡性萎縮中發(fā)揮重要作用,胸腺的增齡性萎縮很大程度上是由胸腺基質細胞的首先改變引起的。大量的研究表明miRNA在胸腺及胸腺內T淋巴細胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,例如miRNA的表達異�？梢云茐男叵傥h(huán)境并且引起T淋巴細胞發(fā)育障礙。與年齡相關的胸腺上皮細胞質量下降趨勢與miRNA的表達變化之間存在相關性,其中miR-146a隨胸腺老化而表達下降的趨勢是最明顯的。可以推測這種表達降低與胸腺微環(huán)境破壞及胸腺萎縮之間存在某種聯(lián)系。在本次實驗中,我們通過過表達小鼠胸腺基質細胞中的miR-146a,觀察其對其下游多個基因的蛋白翻譯水平及胸腺基質細胞凋亡率的影響,試圖在一定程度上分析miR-146a隨年齡下降對胸腺增齡性萎縮的影響及其產生機制。研究方法:1、胸腺基質細胞培養(yǎng)和鑒定:取胸腺后對胸腺基質細胞進行分離純化培養(yǎng),使用DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞一周左右后,消化收集細胞進行流式細胞鑒定。2、模擬物過表達胸腺基質細胞中miR-146a含量:使用miR-146a模擬物及陰性對照試劑在lipomax介導下分別轉染實驗組及對照組胸腺基質細胞。48小時后,分別提取小RNA進行RT-PCR檢測miR-146a表達量。3、TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白濃度檢測:使用lipomax轉染miR-146a模擬物72小時后,分別提取實驗組及對照組的胸腺基質細胞蛋白,進行western blot檢測細胞中TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白。4、胸腺基質細胞凋亡相關檢測:轉染miR-146a模擬物72小時后,分別提取實驗組及對照組的細胞培養(yǎng)液,使用Mouse IL-6Valukine~(TM) ELISA試劑測其中的IL-6含量,并且分別消化收集實驗組與對照組細胞,使用流式細胞術檢測胸腺基質細胞凋亡率。結果:1、胸腺基質細胞培養(yǎng)和鑒定:流式細胞儀鑒定結構顯示,90%以上的細胞(90.78±0.428)%為CD45~-的胸腺基質細胞,不到10%(9.22±0.428)%為CD45~+的淋巴細胞。2、模擬物過表達胸腺基質細胞中miR-146a含量:lipomax轉染miR-146a模擬物48小時后,轉染組細胞中miR-146a表達相對對照組明顯升高。其中轉染組miR-146a相對對照組含量為192.948±54.636,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、TRAF-6蛋白及Smad4蛋白濃度隨miR-146a升高而下降:lipomax轉染miR-146a模擬物72小時后,轉染組細胞中TRAF-6蛋白表達相對對照組明顯降低。其中轉染組TRAF-6蛋白相對對照組含量為0.496±0.254,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Smad4蛋白相對對照組含量為0.377±0.103,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4、IL-6含量隨miR-146a升高而下降:lipomax轉染miR-146a模擬物72小時后,轉染組細胞培養(yǎng)液中的IL-6明顯降低。其中轉染組為1536.843±528.624pg/ml,對照組為7150.165±724.098pg/ml,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。5、過表達miR-146a72小時后胸腺基質細胞凋亡率較對照組減低:lipomax轉染miR-146a模擬物72小時后,轉染組細胞中Bcl-2蛋白表達相對對照組明顯增高。其中轉染組相對對照組含量為2.430±0.292,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。轉染組細胞的凋亡率相對對照組有所減低,其中轉染組的凋亡率為(13.9±1.842)%,對照組為(22.833±3.435)%,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1、胸腺基質細胞中的TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的表達可以被miR-146a所抑制。2、miR-146a可以抑制胸腺基質細胞中IL-6的分泌。3、miR-146a可以增高胸腺基質細胞中Bcl-2蛋白的表達并一定程度上抑制胸腺基質細胞的凋亡。綜上可以考慮在增齡性萎縮的胸腺中,miR-146a可以通過對其靶基因TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的調節(jié)來影響B(tài)cl-2蛋白的表達及胸腺基質細胞的凋亡。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R583
【圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 結果3.1 胸腺基質細胞的培養(yǎng)及鑒定取胸腺后對胸腺基質細胞進行分離純化培養(yǎng)，使用 DMEM/F12 培養(yǎng)一周左右后，消化收集細胞進行流式細胞鑒定。流式細胞儀鑒定結果顯上的細胞（90.78±0.428）%為 CD45-的胸腺基質細胞，不到 10%（9.22為 CD45+的淋巴細胞。（見圖 1）A

中國醫(yī)科大學碩士學位論文在相關性，其中 miR-146a 隨年齡的增加表達降低，并且其降為了分析不同含量 miR-146a 對胸腺基質細胞的影響，使用 m對照試劑在 lipomax 介導下分別轉染實驗組及對照組胸腺基max 轉染 miR-146a 模擬物 48 小時后，分別提取小 RNA 進行 R到轉染組細胞中 miR-146a 表達相對對照組明顯升高。其中轉量為 192.948±54.636，對照組為 1，差異具有統(tǒng)計學意義（

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本文編號：2712955