【摘要】：目的:胸腺是產(chǎn)生自我限制和自身耐受的功能性T淋巴細(xì)胞的主要淋巴器官。來自骨髓的淋巴造血祖細(xì)胞在此分化發(fā)育成成熟的T淋巴細(xì)胞。為了維持能夠支持胸腺細(xì)胞正常分化的微環(huán)境,需要胸腺細(xì)胞和胸腺微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用。研究表明胸腺基質(zhì)微環(huán)境的破壞在胸腺增齡性萎縮中發(fā)揮重要作用,胸腺的增齡性萎縮很大程度上是由胸腺基質(zhì)細(xì)胞的首先改變引起的。大量的研究表明miRNA在胸腺及胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,例如miRNA的表達(dá)異�？梢云茐男叵傥h(huán)境并且引起T淋巴細(xì)胞發(fā)育障礙。與年齡相關(guān)的胸腺上皮細(xì)胞質(zhì)量下降趨勢與miRNA的表達(dá)變化之間存在相關(guān)性,其中miR-146a隨胸腺老化而表達(dá)下降的趨勢是最明顯的。可以推測這種表達(dá)降低與胸腺微環(huán)境破壞及胸腺萎縮之間存在某種聯(lián)系。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們通過過表達(dá)小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞中的miR-146a,觀察其對其下游多個基因的蛋白翻譯水平及胸腺基質(zhì)細(xì)胞凋亡率的影響,試圖在一定程度上分析miR-146a隨年齡下降對胸腺增齡性萎縮的影響及其產(chǎn)生機(jī)制。研究方法:1、胸腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定:取胸腺后對胸腺基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離純化培養(yǎng),使用DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞一周左右后,消化收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定。2、模擬物過表達(dá)胸腺基質(zhì)細(xì)胞中miR-146a含量:使用miR-146a模擬物及陰性對照試劑在lipomax介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組及對照組胸腺基質(zhì)細(xì)胞。48小時后,分別提取小RNA進(jìn)行RT-PCR檢測miR-146a表達(dá)量。3、TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白濃度檢測:使用lipomax轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物72小時后,分別提取實(shí)驗(yàn)組及對照組的胸腺基質(zhì)細(xì)胞蛋白,進(jìn)行western blot檢測細(xì)胞中TRAF-6蛋白,Smad4蛋白及Bcl-2蛋白。4、胸腺基質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)檢測:轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物72小時后,分別提取實(shí)驗(yàn)組及對照組的細(xì)胞培養(yǎng)液,使用Mouse IL-6Valukine~(TM) ELISA試劑測其中的IL-6含量,并且分別消化收集實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腺基質(zhì)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:1、胸腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定:流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)構(gòu)顯示,90%以上的細(xì)胞(90.78±0.428)%為CD45~-的胸腺基質(zhì)細(xì)胞,不到10%(9.22±0.428)%為CD45~+的淋巴細(xì)胞。2、模擬物過表達(dá)胸腺基質(zhì)細(xì)胞中miR-146a含量:lipomax轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物48小時后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-146a表達(dá)相對對照組明顯升高。其中轉(zhuǎn)染組miR-146a相對對照組含量為192.948±54.636,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、TRAF-6蛋白及Smad4蛋白濃度隨miR-146a升高而下降:lipomax轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物72小時后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中TRAF-6蛋白表達(dá)相對對照組明顯降低。其中轉(zhuǎn)染組TRAF-6蛋白相對對照組含量為0.496±0.254,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Smad4蛋白相對對照組含量為0.377±0.103,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4、IL-6含量隨miR-146a升高而下降:lipomax轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物72小時后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-6明顯降低。其中轉(zhuǎn)染組為1536.843±528.624pg/ml,對照組為7150.165±724.098pg/ml,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5、過表達(dá)miR-146a72小時后胸腺基質(zhì)細(xì)胞凋亡率較對照組減低:lipomax轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物72小時后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)相對對照組明顯增高。其中轉(zhuǎn)染組相對對照組含量為2.430±0.292,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率相對對照組有所減低,其中轉(zhuǎn)染組的凋亡率為(13.9±1.842)%,對照組為(22.833±3.435)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、胸腺基質(zhì)細(xì)胞中的TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的表達(dá)可以被miR-146a所抑制。2、miR-146a可以抑制胸腺基質(zhì)細(xì)胞中IL-6的分泌。3、miR-146a可以增高胸腺基質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)并一定程度上抑制胸腺基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。綜上可以考慮在增齡性萎縮的胸腺中,miR-146a可以通過對其靶基因TRAF-6蛋白及Smad4蛋白的調(diào)節(jié)來影響B(tài)cl-2蛋白的表達(dá)及胸腺基質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R583
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 胸腺基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定取胸腺后對胸腺基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，使用 DMEM/F12 培養(yǎng)一周左右后，消化收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯上的細(xì)胞（90.78±0.428）%為 CD45-的胸腺基質(zhì)細(xì)胞，不到 10%（9.22為 CD45+的淋巴細(xì)胞。（見圖 1）A

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文在相關(guān)性，其中 miR-146a 隨年齡的增加表達(dá)降低，并且其降為了分析不同含量 miR-146a 對胸腺基質(zhì)細(xì)胞的影響，使用 m對照試劑在 lipomax 介導(dǎo)下分別轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組及對照組胸腺基max 轉(zhuǎn)染 miR-146a 模擬物 48 小時后，分別提取小 RNA 進(jìn)行 R到轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中 miR-146a 表達(dá)相對對照組明顯升高。其中轉(zhuǎn)量為 192.948±54.636，對照組為 1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

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本文編號：2712955