發(fā)布時(shí)間：2020-06-09 09:49

【摘要】：目的:動(dòng)脈粥樣硬化是2型糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ),而啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化早期改變的就是血管內(nèi)皮功能異常,內(nèi)皮功能異常的表現(xiàn)之一就是遷移功能的變化。T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域因子3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3,Tim3)是表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的一種糖蛋白,與內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)變化的相關(guān)性目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究目的就是確定Tim3蛋白在不同葡萄糖濃度下是否對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能產(chǎn)生影響。方法:以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對(duì)象,應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),阻斷內(nèi)皮細(xì)胞Tim3蛋白表達(dá),并在不同葡萄糖濃度下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在本研究中,實(shí)驗(yàn)分為三大組:正常對(duì)照組,si-Tim3干擾組,si-Tim3無(wú)效干擾組。三組細(xì)胞分別在正常培養(yǎng)基及賦糖培養(yǎng)基(5.5mmol/L葡萄糖或60mmol/L葡萄糖)中培養(yǎng)24h、48h、72h。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞遷移變化。應(yīng)用劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移功能的變化,并計(jì)算培養(yǎng)72h細(xì)胞的細(xì)胞遷移率和遷移數(shù)量。同時(shí)收集培養(yǎng)72h細(xì)胞,通過(guò)Real-time PCR、Western blot分別檢測(cè)Tim3及與細(xì)胞遷移能力相關(guān)的標(biāo)志蛋白(E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1)的mRNA與蛋白表達(dá)水平,并分別應(yīng)用2~(-△△CT)方法和凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)對(duì)其進(jìn)行半定量分析。結(jié)果:1.細(xì)胞形態(tài)正常培養(yǎng)下,正常對(duì)照組及Tim3無(wú)效干擾組細(xì)胞排列整齊,形態(tài)正常;而Tim3干擾組細(xì)胞則排列紊亂、不規(guī)則細(xì)胞比例增多。賦糖培養(yǎng)下,當(dāng)糖濃度為5.5mmol/L時(shí),各組細(xì)胞形態(tài)與在正常培養(yǎng)下的各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時(shí),正常細(xì)胞組的細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)異常,Tim3干擾組細(xì)胞排列紊亂進(jìn)一步加重。2.細(xì)胞遷移變化2.1劃痕實(shí)驗(yàn):正常培養(yǎng)下,正常對(duì)照組遷移率為82.85±3.75%,無(wú)效干擾組細(xì)胞遷移率為82.57±2.15%,Tim3干擾組細(xì)胞遷移率為60.37±7.86%,與正常對(duì)照組相比明顯降低(P0.05)。賦糖培養(yǎng)下,在糖濃度為5.5mmol/L時(shí),正常細(xì)胞組、Tim3無(wú)效干擾組、Tim3干擾組細(xì)胞遷移率分別為82.34±3.52%、79.13±4.91%、65.13±4.08%,與正常培養(yǎng)下的各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組一致;在糖濃度為60mmol/L時(shí),上述三組細(xì)胞遷移率分別為61.36±7.42%、61.24±7.17%、35.58±5.25%,Tim3干擾組細(xì)胞遷移率顯著低于正常細(xì)胞組(P0.05),此條件下培養(yǎng)的三組細(xì)胞遷移率均明顯低于正常培養(yǎng)下各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組的細(xì)胞遷移率。2.2 Transwell實(shí)驗(yàn):通過(guò)遷移細(xì)胞數(shù)量來(lái)反應(yīng)細(xì)胞移動(dòng)能力。正常培養(yǎng)下,正常對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)為144±16個(gè),Tim3干擾組遷移細(xì)胞數(shù)為53±7個(gè),兩組相比差異顯著(P0.05)。Tim3無(wú)效干擾組遷移細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組接近,為148±16個(gè)。賦糖培養(yǎng)下,在糖濃度為5.5mmol/L時(shí),正常細(xì)胞組、Tim3無(wú)效干擾組、Tim3干擾組遷移細(xì)胞數(shù)分別為127±14、134±20、52±8個(gè),與正常培養(yǎng)下的各組情況相似;在糖濃度為60mmol/L時(shí),正常細(xì)胞組遷移細(xì)胞數(shù)為56±8個(gè),Tim3無(wú)效干擾組遷移細(xì)胞數(shù)為52±5個(gè),Tim3干擾組遷移細(xì)胞數(shù)為19±4個(gè),較正常細(xì)胞組顯著減少(P0.05);此條件培養(yǎng)下的三組細(xì)胞遷移數(shù)均明顯低于正常培養(yǎng)下各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組的細(xì)胞遷移數(shù)。3.移動(dòng)標(biāo)志相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)水平變化本研究檢測(cè)了如下四種蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培養(yǎng)下,正常對(duì)照組E-cadherin、α-catenin mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.06和1.00±0.05,Vimentin和ZEB1 m RNA表達(dá)水平分別為1.00±0.05和1.00±0.10。Tim3無(wú)效干擾組上述各蛋白mRNA表達(dá)水平分別為1.13±0.07、0.93±0.06、0.98±0.05和0.92±0.07。Tim3干擾組各蛋白的mRNA表達(dá)水平則分別為2.78±0.29、3.35±0.14、0.44±0.02、0.67±0.02,與正常對(duì)照組相比,E-cadherin、α-catenin mRNA表達(dá)水平顯著增高,而Vimentin和ZEB1 m RNA表達(dá)水平顯著下降(P0.05);進(jìn)行賦糖培養(yǎng),糖濃度為5.5mmol/L時(shí),各蛋白mRNA表達(dá)水平與正常培養(yǎng)下各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時(shí),正常細(xì)胞組E-cadherin和α-catenin mRNA表達(dá)水平分別為3.25±0.11和4.23±0.33,Vimentin和ZEB1mRNA表達(dá)水平分別為0.37±0.03和0.49±0.03。無(wú)效干擾組E-cadherin、α-catenin mRNA表達(dá)水平分別為3.12±0.24和3.96±0.13,Vimentin和ZEB1mRNA表達(dá)水平分別為0.36±0.02和0.49±0.04,與正常細(xì)胞組相比無(wú)明顯差異。Tim3干擾組E-cadherin、α-catenin mRNA表達(dá)水平分別為4.25±0.29和5.34±0.12,Vimentin和ZEB1mRNA表達(dá)水平分別為0.22±0.01和0.18±0.01,與正常細(xì)胞組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。上述四種蛋白mRNA表達(dá)水平與正常培養(yǎng)下各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組相比,E-cadherin和α-catenin明顯增高,Vimentin和ZEB1明顯下降,在Tim3干擾組表現(xiàn)更為明顯,組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.移動(dòng)標(biāo)志相關(guān)蛋白水平變化本研究檢測(cè)了如下四種蛋白:E-cadherin、α-catenin、Vimentin和ZEB1。正常培養(yǎng)下,正常對(duì)照組E-cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)水平分別為1.00±0.07和1.00±0.13,Vimentin和ZEB1蛋白表達(dá)水平分別為1.00±0.07和1.00±0.05。Tim3無(wú)效干擾組上述各蛋白表達(dá)水平分別為0.97±0.11、1.13±0.13、1.06±0.09和0.93±0.09。Tim3干擾組各蛋白的表達(dá)水平則分別為2.43±0.24、3.72±0.33、0.35±0.05和0.41±0.03,與正常對(duì)照組相比,E-cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)水平顯著增高,而Vimentin和ZEB1表達(dá)水平顯著下降(P0.05);進(jìn)行賦糖培養(yǎng),在糖濃度為5.5mmol/L時(shí),各蛋白表達(dá)水平與正常培養(yǎng)下各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組相似;在糖濃度為60mmol/L時(shí),正常細(xì)胞組E-cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)水平分別為2.34±0.11和3.65±0.23,Vimentin和ZEB1表達(dá)水平分別為0.37±0.04和0.40±0.04。無(wú)效干擾組E-cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)水平分別為2.38±0.14和3.68±0.24,Vimentin和ZEB1表達(dá)水平分別為0.36±0.07和0.36±0.04,與正常細(xì)胞組相比無(wú)明顯差異。Tim3干擾組E-cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)水平分別為4.67±0.36和6.20±0.42,Vimentin和ZEB1表達(dá)水平分別為0.24±0.03和0.12±0.02,與正常細(xì)胞組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。上述四種蛋白表達(dá)水平與正常培養(yǎng)下各對(duì)應(yīng)細(xì)胞組相比,E-cadherin、α-catenin明顯增高,而Vimentin和ZEB1明顯下降,在Tim3干擾組表現(xiàn)更為明顯,組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、Tim3蛋白和高糖均與血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能有關(guān),在高糖或Tim3蛋白表達(dá)下降時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力降低。2、Tim3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響?yīng)毩⒂谄咸烟亲饔?但兩者存在疊加作用,在高糖環(huán)境下阻斷Tim3蛋白會(huì)加重血管內(nèi)皮遷移功能的損傷。
【圖文】：

21圖 1. RNA 干擾后各組 Tim3 mRNA 表達(dá)水平對(duì)照組、NC 為無(wú)效干擾序列組、siRNA-1、siR列組（與正常對(duì)照組相比 , **P＜0.01；與 siRN

圖 2 Western blot 檢測(cè) Tim3 蛋白表達(dá)水平：Control 為正常對(duì)照組、NC 為無(wú)效干擾組、siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3別為 3 條干擾序列組（與正常對(duì)照組相比，**P＜0.01；與 siRNA-1 比較，，#P＜0.01）
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2704513