【摘要】：氟是人體必需的微量元素,但過量攝入會造成多系統(tǒng)、多器官的毒性作用,稱為地方性氟中毒,簡稱地氟病。氟中毒不僅能夠損害牙齒、骨骼等骨相器官,還可對非骨相器官造成損傷,如腦。氟中毒可引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,誘導(dǎo)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)的基因或蛋白表達(dá)異常,進(jìn)而對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。Ca~(2+)是細(xì)胞內(nèi)重要的信息分子,L-型鈣離子通道在調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)Ca~(2+)的水平中發(fā)揮重要作用,但氟致細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載的原因及其對腦海馬內(nèi)L-型鈣離子通道及下游凋亡相關(guān)分子的影響鮮有相關(guān)報道。亞慢性和慢性小鼠氟中毒實驗均選用140只初斷乳健康ICR雄性小鼠,適應(yīng)一周后,隨機(jī)平均分為7組。對照組(C)、高氟組(HF)、低氟組(LF)、高氟激動劑組(HF+FPL)、高氟拮抗劑組(HF+NIF)、低氟激動劑組(LF+FPL)、低氟拮抗劑組(LF+NIF)。對照組飲用自來水,高氟組和低氟組分別飲用30和5mg/L的氟化鈉溶液。分別飼養(yǎng)90天與180天,染氟結(jié)束前一周,按體重5mg/(kg·d)分別腹腔注射生理鹽水、鈣離子通道激動劑FPL64176、鈣離子通道拮抗劑Nifedipine。聯(lián)合氟染毒結(jié)束后,觀測小鼠空間自主探索能力和學(xué)習(xí)記憶力及觀察氟斑牙發(fā)生情況、檢測各組血/尿氟含量,以驗證小鼠氟中毒模型是否復(fù)制成功。再檢測SOD、GSH-PX活力及MDA含量、海馬CA_1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡情況、鈣離子通道Cav1.2、鈣調(diào)蛋白CaM、鈣調(diào)蛋白激酶CaMKⅡ、Bcl-2和Bax基因和蛋白表達(dá)水平。通過上述實驗,探討飲水型氟暴露致腦功能損傷的分子機(jī)制,初步探明L-型鈣通道在飲水型氟中毒致腦功能損傷過程中的作用,進(jìn)一步完善氟致“鈣矛盾”學(xué)說,探求治療氟中毒的新途徑和新方法。研究結(jié)果如下:(1)血/尿氟含量測定結(jié)果顯示,與對照(C)組比,3月齡和6月齡各染氟組尿氟含量顯著上升(P0.05)。另外,LF組切齒有較輕的氟斑牙癥狀。HF組切齒氟斑牙癥狀顯著。根據(jù)以上指標(biāo)可認(rèn)為本研究氟中毒模型復(fù)制成功。(2)行為檢測結(jié)果顯示,與C組比,3月齡和6月齡小鼠不同氟濃度暴露后跑動格數(shù)和站立次數(shù)較對照組有下降趨勢,逃避潛伏期顯著下降(P0.05),穿越平臺次數(shù)明顯下降,表明氟染毒小鼠空間探索和學(xué)習(xí)記憶能力下降。(3)腦組織相關(guān)酶檢測結(jié)果顯示,與C組比,3月齡和6月齡染氟組小鼠腦組織GSH-Px較對照組活力降低。SOD活力及MDA含量顯著升高(P0.05)。6月齡較3月齡HF+NIF組MDA含量顯著下降(P0.05)。(4)海馬CA_1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和凋亡檢測結(jié)果顯示,與C組比,氟染毒3個月和6個月小鼠腦海馬染氟組細(xì)胞形態(tài)改變。3月齡及6月齡不同濃度的氟染毒組腦海馬CA_1區(qū)細(xì)胞凋亡率顯著性升高(P0.05),拮抗劑組海馬CA_1區(qū)細(xì)胞凋亡率較激動劑組顯著降低(P0.05),但高于對照組。染氟6個月較3個月相同濃度氟處理組海馬CA_1區(qū)細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P0.01)。(5)PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示,與C組比,HF和LF組3月齡和6月齡海馬內(nèi)Cav1.2基因表達(dá)水平均顯著升高(P0.05),但蛋白表達(dá)水平顯著下降。3月齡和6月齡CaM基因表達(dá)水平顯著下降(P0.05),但蛋白表達(dá)水平升高,其表達(dá)水平不一致的原因,有待進(jìn)一步闡明。3月齡CaMKⅡ基因和蛋白表達(dá)水平均有下降趨勢,而6月齡顯著升高。3月齡和6月齡Bax基因和蛋白表達(dá)水平及Bax/Bcl-2基因和蛋白表達(dá)水平比值均顯著升高(P0.05),而Bcl-2基因表達(dá)水平均顯著降低(P0.05)。與相同氟濃度染毒組比,3月齡激動劑組Cav1.2基因和蛋白表達(dá)水平顯著下降(P0.05),拮抗劑組有降低趨勢。3月齡和6月齡CaM基因和蛋白表達(dá)水平有升高的趨勢,拮抗劑組有下降的趨勢。3月齡激動劑組和拮抗劑組CaMKⅡ基因和蛋白表達(dá)水平均有下降的趨勢,而6月齡無統(tǒng)計學(xué)意義。3月齡激動劑組和拮抗劑組Bax基因和蛋白表達(dá)水平無明顯顯著性(P0.05),而6月齡激動劑組有上升的趨勢,拮抗劑組有下降趨勢。3月齡和6月齡激動劑組Bcl-2基因和蛋白表達(dá)水平均有下降趨勢,拮抗劑組有升高趨勢。3月齡和6月齡激動劑組Bax/Bcl-2基因和蛋白表達(dá)水平比值顯著升高(P0.05),拮抗劑組有下降趨勢。綜合上述,本研究在飲水型氟中毒模型復(fù)制成功的基礎(chǔ)上,所得研究結(jié)果表明,亞慢性和慢性氟中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶力、自主行為和探究能力下降,腦組織抗氧化能力降低,海馬CA_1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)增加。這可能與腦海馬內(nèi)鈣離子通道Cav1.2蛋白和凋亡相關(guān)分子Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)異常及Bax/Bcl-2表達(dá)比值升高有關(guān),且海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)上述分子的表達(dá)水平與氟暴露的劑量及時間呈正相關(guān)。提示,腦海馬內(nèi)Bcl-2、Bax凋亡途徑可能是氟致小鼠行為改變及腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制之一。此外,Ca~(2+)通道激動劑FPL64176能進(jìn)一步加劇氟引起的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的損傷,并并腦海馬細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道Cav1.2及下游CaMK II、CaM與Bcl-2、Bax基因和蛋白表達(dá)異常程度加基,表現(xiàn)出協(xié)同毒性作用,而鈣離子拮抗劑Nifedipine則可逆轉(zhuǎn)氟中毒對小鼠上述行為及分子異常表達(dá),提示鈣離子拮抗劑Nifedipine可能是一種新型有效的抗氟藥。
【圖文】：

高；與 LF 組相比，3 月齡小鼠 LF+FPL 組尿鈣含量顯著降低(P<0.05)，組極顯著降低(P<0.01)。與 3 月齡比，6 月齡小鼠 HF+NIF 組、LF+FPL 組尿鈣含量顯著降低(PLF+NIF 組尿氟含量極顯著降低(P<0.01)。3.2 小鼠下切齒氟斑牙觀察結(jié)果3 月齡和 6 月齡各組小鼠下切齒通過顯微鏡觀察并拍照，觀察結(jié)果見

圖 2 3 月齡和 6 月齡小鼠 Morris 水迷宮穿越平臺數(shù)檢測結(jié)果(n=10)re 2 Results of Morris water maze crossing platform in 3 and 6 months old mice(*P<0.05，**P<0.01，與 C 組比;#P<0.05，與 HF 組比;+P<0.05，++P<0.01，與0.05，△ △P<0.01,與 3 月齡比圖 2 可見，與 C 組比，3 月齡小鼠 HF 組穿越平臺數(shù)顯著下降(P<PL 組小鼠穿越平臺數(shù)極顯著下降(P<0.01)。6 月齡小鼠 LF 組、LF+臺數(shù)極顯著下降(P<0.01)，LF+NIF 組穿越平臺數(shù)顯著降低(P<0.0比，6月齡小鼠HF+NIF組顯著升高(P<0.05)。與LF組比，3月齡小鼠L平臺數(shù)極顯著下降(P<0.01)，LF+NIF 組穿越平臺數(shù)顯著降低(P<0鼠 LF+FPL 組、LF+NIF 組穿越平臺數(shù)無顯著性變化(P>0.05)。 3 月齡比，6 月齡小鼠 LF 組、LF+FPL 組穿越平臺數(shù)顯著降低(P<小鼠腦海馬 CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R599.1

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本文編號：2691003