【摘要】：糖尿病是全球最普遍的代謝疾病之一,目前的治療方法有胰島移植及使用降血糖藥物等,但前者缺乏移植供體且有移植排異風(fēng)險,后者會出現(xiàn)較多不良反應(yīng)。在細(xì)胞水平上可通過定向誘導(dǎo)的方法,將多潛能性干細(xì)胞向具有胰島素分泌功能的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,可為治療糖尿病提供一種新的療法。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose mesenchymal stem cells,haMSCs)來源于脂肪組織,易于分離培養(yǎng),且較少涉及到醫(yī)學(xué)倫理問題,是糖尿病等細(xì)胞治療的理想來源。MiR-375、Pdx1和MafA在胰腺、胰島細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中起到重要的調(diào)控作用。miR-375作為胰島特異性miRNA,參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,可以促進(jìn)細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells,IPCs)分化。Pdx1是胰腺發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)胰島素的分泌,并激活特異性基因的表達(dá)。MafA在Pdx1等基因的協(xié)同作用下,可誘導(dǎo)體外胰島素的分泌。為了探究過表達(dá)這三種轉(zhuǎn)錄因子對haMSCs向IPCs分化的影響,我們利用慢病毒載體構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)miR-375、Pdx-1以及MafA的haMSC細(xì)胞株,并將其誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞。首先,我們從捐贈者的前腹壁切除的脂肪組織中分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)細(xì)胞,在體外培養(yǎng)并多次傳代后,細(xì)胞形態(tài)仍保持為與成纖維細(xì)胞相似的紡錘形,且貼壁生長狀態(tài)良好。通過茜素紅、阿爾新藍(lán)、油紅O和BODIPY探針染色分別對haMSCs成骨、成軟骨和成脂誘導(dǎo)分化進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示haMSCs具有分化成骨、軟骨和脂肪細(xì)胞的能力;通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物的表達(dá),結(jié)果顯示表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105、CD166等脂肪間充質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,而CD34、CD45、CD133、CD271等表達(dá)陰性,表明我們成功分離得到haMSCs。其次,根據(jù)miR-375、Pdx1和MafA的基因序列構(gòu)建慢病毒載體,對haMSCs進(jìn)行感染,獲得過表達(dá)miR-375、過表達(dá)miR-375和Pdx-1、過表達(dá)miR-375、Pdx-1和MafA細(xì)胞株。MiR-375、Pdx-1和MafA過表達(dá)的細(xì)胞在感染72 h后可觀察到細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá),感染率約為80%,且細(xì)胞傳代后依然表達(dá)綠色熒光蛋白,表明穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株建系成功。最后,利用三階段的分化體系進(jìn)行分化,先在添加CYC、NOGGIN和RA的基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后,再用含有Nic、NOGGIN和GLP1的基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3天,最后于添加Nic、NOGGIN、GLP1和IGF1的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)7天。該體系可將haMSCs成功誘導(dǎo)分化為IPCs。對過表達(dá)細(xì)胞向IPCs誘導(dǎo)分化后的RT-PCR檢測結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,Insulin、Glucagon、Pdx1、Ngn3、Foxa2、Isl.1、Nkx6.1等胰腺相關(guān)基因的表達(dá)均有上調(diào)。Insulin、Glucagon的相對表達(dá)量最高可上調(diào)約47.7倍和15.7倍,Pdx1由于進(jìn)行慢病毒過表達(dá)最高可上調(diào)約500倍,Somatostatin最高可上調(diào)約36倍,Ngn3、Foxa2、Isl.1的相對表達(dá)量最高可上調(diào)約7倍,Nkx6.1最高可上調(diào)3倍左右,表明過表達(dá)胰腺相關(guān)因子確實(shí)可促進(jìn)細(xì)胞的胰向分化。其中同時過表達(dá)miR-375、Pdx-1和MafA的細(xì)胞與其他組細(xì)胞相比,Insulin、Pdx1和Ngn3的相對表達(dá)量上調(diào)程度更高,而Glucagon的上調(diào)程度較低。免疫熒光染色的結(jié)果顯示,細(xì)胞呈現(xiàn)Insulin、Glucagon、Pdx1和Somatostatin的表達(dá)陽性。Elisa測定結(jié)果顯示,同時過表達(dá)miR-375、Pdx-1和MafA的組中平均單個細(xì)胞的胰島素分泌量為3.6×10~(-4)μg,而在其他組細(xì)胞中未檢測到胰島素的分泌。研究證明,過表達(dá)MiR-375、Pdx-1和MafA可以促進(jìn)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化,且同時表達(dá)miR-375、Pdx-1和MafA的細(xì)胞與過表達(dá)miR-375、過表達(dá)miR-375和Pdx-1的細(xì)胞相比,具有更好的分化效果。表明過表達(dá)多種胰向分化轉(zhuǎn)錄因子可協(xié)同促進(jìn)haMSCs向IPCs的分化,可以為用自身細(xì)胞治療糖尿病提供臨床研究的可能。
【圖文】：

圖 1.1 haMSCs 不同時間、不同代次的生長狀態(tài)A：第 3 代 haMSC 培養(yǎng) 48 h 后的形態(tài)。B：第 3 代 haMSC 培養(yǎng) 72 h 后的形態(tài)。C：第 8 代 haMSC 培養(yǎng)48 h 后的形態(tài)。（標(biāo)尺為 100 μm）Figure 1.1 The morphology of of haMSCs at different generation

98.2%，90.4%；陰性標(biāo)志物中除 CD14 的表達(dá)為 0.6%，CD34、CD45、CD133、CD271 的表達(dá)均為 0%（圖1.2）。由此可見，細(xì)胞陽性表面標(biāo)志物的表達(dá)均大于 90%，陰性表面標(biāo)志物的表達(dá)均接近于 0或等于 0，，與已發(fā)表的研究結(jié)論一致，表明該細(xì)胞可表達(dá)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1

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本文編號：2690148