發(fā)布時間：2020-05-20 00:48

【摘要】：背景糖尿病皮膚潰瘍是糖尿病患者由于神經(jīng)血管病變導致微循環(huán)障礙而發(fā)生的潰瘍和壞疽,往往遷延難愈,使患者預期壽命及生活質量顯著下降。然而,糖尿病傷口愈合延遲或缺乏愈合的原因仍不清楚,并且可加速或促進其修復的治療方法仍然有限。內(nèi)皮細胞在血管生成中起重要作用,在血管生成時,血管內(nèi)皮細胞被快速激活并遷移到遠處位點進行增殖,從現(xiàn)有毛細血管形成新的初級毛細血管以促進組織修復,內(nèi)皮功能障礙是糖尿病微血管和大血管并發(fā)癥的基礎。外泌體和mi RNA是參與糖尿病發(fā)病機制的重要分子,這些分子可以通過靶向參與糖尿病發(fā)病不同階段的細胞和分子途徑來發(fā)揮其作用。已經(jīng)有研究報道,內(nèi)皮祖細胞分泌的外泌體對血管內(nèi)皮損傷的修復作用,但其具體分子機制仍未闡明。目的(1)探究內(nèi)皮祖細胞外泌體和人臍靜脈內(nèi)皮細胞外泌體mi RNA表達譜及差異。(2)明確內(nèi)皮祖細胞外泌體對糖尿病皮膚損傷的修復作用。(3)探究內(nèi)皮祖細胞外泌體中包含的mi RNA-221-3p對糖尿病皮膚損傷的修復作用和機制。方法(1)細胞免疫熒光實驗將誘導成的內(nèi)皮祖細胞孵育CD133、Fl K-1抗體,然后孵育二抗,用熒光顯微鏡觀察免疫熒光情況。(2)內(nèi)皮祖細胞外泌體和臍靜脈細胞外泌體mi RNA高通量測序分別從原代培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞和臍靜脈細胞提取的外泌體,進行mi RNA建庫和上機測序后,將原始數(shù)據(jù)過濾后使用相應軟件進行定性和定量。(3)細胞劃痕實驗將胸主動脈內(nèi)皮細胞使用mi RNA-221-3p轉染處理后12小時在顯微鏡下進行觀察和拍攝,觀察細胞的運動及遷移能力改變。(4)免疫組化實驗將對照組和實驗組小鼠處死,取傷口愈合處真皮層皮膚組織進行免疫組化,觀察真皮層CD31、Ki67、VEGF和PCNA表達量的改變情況。結果(1)免疫熒光實驗結果顯示,兩個標志性蛋白CD133和Fl K-1皆呈陽性,顯示內(nèi)皮祖細胞被誘導分化成功。(2)通過人臍靜脈內(nèi)皮細胞和內(nèi)皮祖細胞外泌體mi RNA高通量測序結果顯示,內(nèi)皮祖細胞外泌體與人臍靜脈內(nèi)皮細胞外泌體在mi RNA表達譜上有明顯差異,并通過差異靶基因的功能和信號通路分析,顯示出內(nèi)皮祖細胞外泌體mi RNA的主要功能。(3)通過構建小鼠皮膚損傷模型,涂抹內(nèi)皮祖細胞外泌體或mi RNA-221-3p觀察皮膚愈合情況,發(fā)現(xiàn)外泌體和mi RNA-221-3p都可以促進正常小鼠和糖尿病小鼠傷口愈合。(4)免疫組化結果顯示,內(nèi)皮祖外泌體和mi RNA-221-3p孵育后的糖尿病皮膚損傷模型的皮膚處CD31、Ki67、VEGF和PCNA顯著增加,并且新生血管增多。(5)細胞劃痕實驗結果顯示,mi RNA-221-3p可以顯著增強胸主動脈內(nèi)皮細胞的遷移能力。結論(1)內(nèi)皮祖細胞外泌體和mi RNA-221-3p可以促進糖尿病小鼠傷口愈合,并且導致CD31,Ki67、VEGF和PCNA蛋白表達增加,新生血管生成增加。(2)mi RNA-221-3p可以促進胸主動脈內(nèi)皮細胞遷移能力。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文20行免疫熒光實驗鑒定，結果如圖1所示。結果顯示CD133呈陽性，F(xiàn)lK-1也呈強陽性，這說明小鼠原代內(nèi)皮祖細胞被成功的誘導分化。圖1：原代培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞FlK-1、CD133免疫熒光鑒定（×200）Fig 1. The FlK-1 and CD133 of the differentiated endothelial progenitor cells werestrongly positive（×200）3.2 內(nèi)皮祖細胞和臍靜脈細胞外泌體 miRNAs 高通量測序數(shù)據(jù)的初步分析結果我們一共檢測 8 個樣本，包括四個內(nèi)皮祖細胞和四個臍靜脈內(nèi)皮細胞外泌體miRNA 。 編 號 分 別 是 EPCs-Exo1 ， EPCs-Exo2 ， EPCs-Exo3 ， EPCs-Exo4 ，HUVCEs-Exo1

TypeEPCs-Exo 1EPCs-Exo 2EPCs-Exo 3EPCs-Exo4HUVCEs-Exo1HUVCEs-Exo2HUVCEs-Exo3HUVCEs-Exo4Total_reads 13006725 1405817814232291 16826016 13475955 12925316 12849858 14576043Clean_reads 12394166 1353231213777508 16287231 12842966 12441322 12278390 13798049Size 304 M 334 M 331 M 379 M 317 M 304 M 304 M 340 M% 95.74% 96.63% 97.18% 97.17% 95.75% 96.70% 96.07% 95.16%表 1：Raw data 過濾結果Tab1. Filtered data3.3 內(nèi)皮祖細胞和臍靜脈內(nèi)皮細胞外泌體 miRNAs 數(shù)據(jù)的質檢報告為了判斷過濾后數(shù)據(jù)是否屬于高質量數(shù)據(jù)，我們通過常用的質量檢測軟件FastQC 對 Clean data 進行數(shù)據(jù)質量檢控。并且使用 Multiqc（v.1.6）軟件進行整合，結果如圖 4 所示，我們發(fā)現(xiàn)所有的堿基質量都位于 Q30 之上，這說明我們獲得了高質量的 reads，并且完全可以用于下一步的分析。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1

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本文編號：2671746