【摘要】：研究背景肥胖是由于體內(nèi)脂肪堆積過(guò)多或分布異常而引起的全身性低度炎癥的慢性疾病。近年來(lái),隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展,生活節(jié)奏的不斷加快,中國(guó)人群的超重率和肥胖率均不斷上升,體重超標(biāo)和肥胖問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。截止2016年,全球約有21億超重或肥胖人口,而中國(guó)的肥胖率目前為17%左右,總肥胖人口數(shù)達(dá)8960萬(wàn)人,已成為全球肥胖人口最多的國(guó)家。肥胖既是一種獨(dú)立性疾病,又是高血壓、糖尿病、冠心病等一系列慢性疾病的重要危險(xiǎn)因素,甚至可導(dǎo)致某些癌癥等惡性疾病的發(fā)生。由此可見(jiàn),全球范圍內(nèi)流行的肥胖以及由此引起的代謝綜合征,已成為21世紀(jì)的全球公共衛(wèi)生危機(jī)。因此,探明肥胖發(fā)生、發(fā)展的重要分子機(jī)制、明確關(guān)鍵靶標(biāo)基因,對(duì)預(yù)防和治療肥胖及相關(guān)代謝性疾病具有十分重要的理論價(jià)值及現(xiàn)實(shí)意義。在肥胖的發(fā)展進(jìn)程中,脂肪組織是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)。脂肪組織中含有多種免疫細(xì)胞,其中巨噬細(xì)胞是參與肥胖發(fā)生的最主要免疫細(xì)胞群,巨噬細(xì)胞也是發(fā)揮促炎、引起胰島素抵抗的關(guān)鍵環(huán)節(jié),與正常脂肪組織相比,其數(shù)量可增加50%,巨噬細(xì)胞已成為目前肥胖免疫學(xué)致病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到脂肪中稱(chēng)為脂肪組織巨噬細(xì)胞(adipose tissue macrophages,ATMs),ATMs有兩種功能和表型截然不同的細(xì)胞亞型,即經(jīng)典激活的、具有促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞和替代激活的、具有抗炎作用的M2型巨噬細(xì)胞。Ml型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎因子,使脂肪組織產(chǎn)生慢性炎癥從而導(dǎo)致代謝紊亂和胰島素抵抗。而脂肪組織中的M2型巨噬細(xì)胞可以抑制脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚,并增強(qiáng)棕色脂肪的產(chǎn)熱功能,誘導(dǎo)白色脂肪的米色化,從而有助于維持脂肪組織的代謝穩(wěn)態(tài)。Ml和M2型巨噬細(xì)胞在脂肪組織中所占比例存在動(dòng)態(tài)平衡,調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變的因素與肥胖的發(fā)生密切相關(guān),ATMs的異質(zhì)性和可塑性是其在肥胖中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵因素。因此,明確維持ATMs功能穩(wěn)態(tài)的調(diào)控分子可為干預(yù)肥胖進(jìn)程提供有效的解決措施。免疫調(diào)節(jié)分子T細(xì)胞免疫球蛋白域與黏蛋白域4(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 4,Tim-4)是于2001年發(fā)現(xiàn)的Tim基因家族成員,該分子選擇性高表達(dá)于巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞,而不表達(dá)于T細(xì)胞。已有多項(xiàng)研究證實(shí)Tim-4可抑制巨噬細(xì)胞活性并參與肝臟免疫穩(wěn)態(tài)及自身免疫病等,表明Tim-4在免疫相關(guān)疾病中的重要性,但Tim-4在肥胖中的作用未見(jiàn)報(bào)道。雖有文獻(xiàn)報(bào)道,居留M2樣巨噬細(xì)胞高表達(dá)Tim-4,但其在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用并不清楚。基于巨噬細(xì)胞在肥胖發(fā)生、進(jìn)展中的關(guān)鍵作用及Tim-4對(duì)巨噬細(xì)胞的負(fù)調(diào)控作用,結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和本課題組前期研究結(jié)果,我們提出假說(shuō):Tim-4可能通過(guò)調(diào)控ATMs參與肥胖的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。研究目的本課題以肥胖為研究模型,探討Tim-4在肥胖發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵作用及其分子機(jī)制,為肥胖的臨床治療尋找新的靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜缦?1.明確肥胖微環(huán)境對(duì)Tim-4表達(dá)的影響2.探明Tim-4在肥胖中的作用3.明確Tim-4對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響4.闡明Tim-4調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制5.明確Tim-4調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在肥胖進(jìn)展中的作用方法與結(jié)果1.肥胖微環(huán)境對(duì)Tim-4表達(dá)的影響1.1肥胖小鼠脂肪組織內(nèi)Tim-4的表達(dá)升高首先,我們選擇野生型(WT)小鼠通過(guò)高脂飲食(High-fat diet,HFD)誘導(dǎo)建立肥胖模型及db/db自發(fā)性肥胖小鼠,利用qPCR和Western blot(WB)技術(shù)檢測(cè)HFD小鼠、db/db小鼠和正常飲食的對(duì)照小鼠脂肪組織中Tim-4的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HFD小鼠、db/db小鼠脂肪組織中Tim-4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯上調(diào)。此結(jié)果提示,肥胖微環(huán)境可誘導(dǎo)脂肪組織中Tim-4的表達(dá)。1.2肥胖脂肪組織SVFs內(nèi)Tim-4的表達(dá)升高為了明確脂肪組織血管基質(zhì)成分(stromal vascular fraction cells,SVFs)中Tim-4的表達(dá),我們提取了db/db小鼠及其同齡對(duì)照小鼠皮下脂肪組織內(nèi)的SVFs,分別利用qPCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SVFs中的Tim-4mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,肥胖小鼠脂肪組織中SVFs及ATMs均高表達(dá)Tim-4。免疫熒光技術(shù)也進(jìn)一步證實(shí),db/db肥胖小鼠脂肪組織中的巨噬細(xì)胞表達(dá)Tim-4的水平上調(diào)。上述結(jié)果表明,肥胖小鼠ATMs中的Tim-4表達(dá)上調(diào)。1.3肥胖小鼠血清刺激上調(diào)巨噬細(xì)胞中Tim-4的表達(dá)為了進(jìn)一步明確Tim-4表達(dá)與肥胖的相關(guān)性,我們利用肥胖小鼠血清(占培養(yǎng)基比:20%)模擬肥胖微環(huán)境,體外刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(bone morrow-derived macrophage,BMDM)。通過(guò)qPCR、WB及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMDM在肥胖小鼠血清刺激后Tim-4的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠來(lái)源的血清刺激后,BMDM表達(dá)Tim-4的水平上調(diào)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明,肥胖微環(huán)境可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中Tim-4的表達(dá),提示Tim-4可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞參與肥胖的發(fā)生、發(fā)展。2.Tim-4在肥胖中的作用2.1 Tim-4敲除小鼠的鑒定為了更好地研究Tim-4分子在肥胖發(fā)生、發(fā)展中的作用,實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了Tim-4基因全身敲除(Tim-4-/-或Tim-4KO)的小鼠,并以此為模型開(kāi)展相關(guān)研究。通過(guò)qPCR、WB及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了 SVFs、BMDM以及腹腔居留巨噬細(xì)胞中Tim-4的表達(dá),結(jié)果顯示,Tim-4-/-小鼠具有明顯的敲除效果,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。2.2 Tim-4敲除可促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖進(jìn)程2.2.1 Tim-4敲除可加重高脂誘導(dǎo)的小鼠肥胖程度為了明確Tim-4在肥胖中的作用,利用WT和Tim-4-/-小鼠分別進(jìn)行高脂飼喂20周建立肥胖模型。在構(gòu)建肥胖模型的過(guò)程中,每周進(jìn)行體重監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)在高脂飼喂14周后,Tim-4-/-組小鼠體重開(kāi)始有明顯升高的趨勢(shì)。20周后處死小鼠,發(fā)現(xiàn)Tim-4-/-組小鼠皮下、附睪、內(nèi)臟各部分脂肪組織的重量均較高,而且HE染色結(jié)果顯示,Tim-4-/-組小鼠的脂肪細(xì)胞也明顯增大。另外,為了明確兩組小鼠的血糖調(diào)控能力是否存在差異,在高脂飼喂20周后,檢測(cè)兩組肥胖模型小鼠的糖耐量以及胰島素抵抗。結(jié)果顯示,Tim-4-/-組小鼠出現(xiàn)糖耐量減弱以及胰島素抵抗增強(qiáng)的趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明,在高脂飲食構(gòu)建的肥胖模型中,Tim-4敲除可加重HFD誘導(dǎo)的小鼠肥胖程度。2.2.2 Tim-4敲除可加重肥胖引起的相關(guān)代謝紊亂我們進(jìn)一步檢測(cè)了兩組肥胖模型小鼠血清中脂代謝及糖代謝相關(guān)分子的表達(dá)。首先發(fā)現(xiàn),Tim-4-/-組小鼠的血清中甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,T-CHO)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平高于對(duì)照組。另外,利用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中胰島素、瘦素、脂聯(lián)素的水平,結(jié)果顯示,Tim-4-/-組小鼠對(duì)胰島素及瘦素的抵抗增強(qiáng),而血清內(nèi)能夠改善胰島素敏感性的脂聯(lián)素水平則顯著降低,說(shuō)明Tim-4敲除后可加重肥胖引起的相關(guān)代謝紊亂。以上結(jié)果進(jìn)一步提示,Tim-4敲除后可促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。2.3 Tim-4敲除對(duì)高脂誘導(dǎo)肥胖模型小鼠能量代謝的影響由于脂肪組織在能量代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,我們?cè)诟咧曃?0周時(shí),利用代謝籠檢測(cè)兩組肥胖小鼠能量代謝的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tim-4-/-組小鼠耗氧量水平顯著降低,提示Tim-4敲除后可抑制小鼠能量代謝的水平。為了更加明確Tim-4是否影響脂肪組織調(diào)控能量代謝,我們分離了兩組肥胖模型小鼠的棕色脂肪及白色脂肪,利用qPCR和WB技術(shù)檢測(cè)棕色脂肪組織中產(chǎn)熱功能的標(biāo)記分子解偶聯(lián)蛋白l(uncoupling protein 1,UCP1),發(fā)現(xiàn)Tim-4敲除后可降低UCP1的表達(dá),提示Tim-4敲除后減弱棕色脂肪的產(chǎn)熱功能。另外,白色脂肪的米色化也是增強(qiáng)能量代謝的重要方式,因此利用qPCR技術(shù)檢測(cè)皮下脂肪組織中米色化指標(biāo)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Tim-4敲除后UCP-1、Ear2、Tmem26、CD137mRNA的水平顯著降低。以上結(jié)果均表明,Tim-4敲除后可使小鼠的能量代謝功能減弱。3.Tim-4對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響ATMs的極化和招募在肥胖的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,在肥胖的脂肪組織中,M1/M2型巨噬細(xì)胞的比例出現(xiàn)失衡,即M1型促炎巨噬細(xì)胞比例上調(diào),M2型抑炎巨噬細(xì)胞比例下調(diào),從而導(dǎo)致脂肪組織慢性炎癥,而脂肪組織的局部炎癥也會(huì)促進(jìn)周邊組織巨噬細(xì)胞募集至脂肪組織,從而進(jìn)一步促進(jìn)肥胖的發(fā)展進(jìn)程。3.1 Tim-4敲除對(duì)高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞表型的影響利用Tim-4-/-和同窩對(duì)照小鼠通過(guò)HFD建立肥胖模型,ELISA檢測(cè)血清炎癥因子水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tim-4-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6的水平上調(diào),提示Tim-4敲除后促進(jìn)全身炎癥水平。提取兩組肥胖小鼠皮下脂肪組織的SVFs,利用qPCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SVFs內(nèi)M1/M2巨噬細(xì)胞的比例。qPCR結(jié)果顯示,Tim-4-/-小鼠SVFs中高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性分子,如iNOS、TNF-α、Ccl2等,而低表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性分子,如CD206、Argl、Retnla等。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也表明,Tim-4-/-小鼠ATMs中Ml型巨噬細(xì)胞(CDllb+CDllc+)比例上調(diào)、M2型巨噬細(xì)胞(CDllb+CD206+)比例下調(diào)。另外,免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示,Tim-4-/-小鼠ATMs中iNOS上調(diào)、Ym-1的表達(dá)下調(diào)。最后,我們還利用WB技術(shù)檢測(cè)了附睪脂肪組織的SVFs中iNOS及Ym-1的表達(dá),所得結(jié)論與免疫熒光的結(jié)果一致。以上結(jié)果共同表明,Tim-4敲除后可導(dǎo)致高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠模型SVFs內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞的比例降低,從而促進(jìn)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。3.2 Tim-4調(diào)控M1/M2巨噬細(xì)胞的比例平衡3.2.1 Tim-4敲除可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)促炎因子的表達(dá)為了進(jìn)一步明確Tim-4對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用,分別誘導(dǎo)培養(yǎng)正常飲食的Tim-4-/-與WT 鼠的BMDM,利用 LPS(100ng/ml)或IL-4(20ng/ml)處理24h,然后檢測(cè)刺激前后巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)變化。利用qPCR技術(shù)檢測(cè)M1/M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記分子的表達(dá),與SVFs結(jié)果相一致,當(dāng)利用LPS將BMDM誘導(dǎo)成M1表型后,與對(duì)照組相比,Tim-4-/-小鼠來(lái)源的BMDM高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志性分子,如iNOS、TNF-α、Ccl2等,而當(dāng)利用IL-4將BMDM誘導(dǎo)成M2表型后,Tim-4-/-小鼠來(lái)源的BMDM低表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性分子,如CD206、Argl、Retnla等。WB結(jié)果顯示,LPS刺激后Tim-4-/-組小鼠的BMDM表達(dá)iNOS的水平上調(diào),而IL-4刺激后則可下調(diào)Ym-1的表達(dá)。以上結(jié)果表明,Tim-4敲除后可促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)促炎因子的表達(dá),提示Tim-4可能與巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。3.2.2 Tim-4敲除可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1促炎表型轉(zhuǎn)化為了明確Tim-4在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LPS或IL-4刺激后兩組巨噬細(xì)胞的表型變化。結(jié)果顯示,LPS刺激后Tim-4敲除使Ml型巨噬細(xì)胞的比例上調(diào),同時(shí)IL-4刺激后M2型巨噬細(xì)胞比例下調(diào)。以上結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果一致,表明Tim-4敲除后導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞的比例下調(diào),提示Tim-4可能通過(guò)調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞的平衡參與肥胖進(jìn)程。為了明確肥胖微環(huán)境對(duì)Tim-4調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞平衡的影響,利用肥胖小鼠血清分別刺激Tim-4-/-及對(duì)照小鼠來(lái)源的BMDM,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表型變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-4-/-小鼠來(lái)源的BMDM經(jīng)肥胖小鼠血清刺激后M1型巨噬細(xì)胞比例上調(diào),M2型巨噬細(xì)胞比例下調(diào)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明,Tim-4可調(diào)控M1/M2型巨噬細(xì)胞的比例平衡。4.Tim-4調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制巨噬細(xì)胞在維持M1/M2表型的平衡會(huì)涉及多種機(jī)制,目前比較明確的主要信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子有:信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)、核因子κB(NF-κB)、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)以及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、肝X受體(LXR)等。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn),Tim-4可通過(guò)NF-κB通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,推測(cè)Tim-4可能通過(guò)NF-κB通路調(diào)控M1/M2型巨噬細(xì)胞的比例平衡。4.1 Tim-4對(duì)NF-κB通路的影響為進(jìn)一步明確肥胖微環(huán)境下Tim-4對(duì)NF-κB通路的影響,我們利用db/db肥胖小鼠及對(duì)照小鼠血清分別刺激Tim-4敲除與WT鼠來(lái)源的BMDM,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠的血清可以促進(jìn)兩組BMDM中NF-κB p65的磷酸化,但Tim-4-/-組NF-κB p65的活化程度更強(qiáng)。利用HEK293細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Tim-4過(guò)表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒DNA,然后均轉(zhuǎn)染pNF-KB-luc雙熒光報(bào)告基因質(zhì)粒,檢測(cè)兩組中NF-κB的激活水平是否存在差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tim-4過(guò)表達(dá)后可以抑制NF-κB的激活。Tim-4-/-與WT小鼠的BMDM分別利用LPS(100ng/ml)進(jìn)行刺激,于刺激后0、15、30min收取細(xì)胞蛋白,利用WB技術(shù)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路中IKKα/β、IKBα、p65的活化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LPS的刺激下,Tim-4敲除可增強(qiáng)NF-κB信號(hào)通路中IKKα/β、IKBα、p65的活化。以上結(jié)果證明,Tim-4敲除后可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB通路的活化。4.2 Tim-4通過(guò)NF-κB通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化為了明確NF-κB通路在Tim-4調(diào)控巨噬細(xì)胞極化中的作用,我們利用NF-κB通路抑制劑對(duì)BMDM進(jìn)行處理,觀察Tim-4-/-與WT小鼠的BMDM表達(dá)M1、M2型巨噬細(xì)胞表型分子的差異。首先,對(duì)兩組BMDM進(jìn)行LPS刺激18h后,然后分別加入DMSO及NF-κB通路抑制劑處理6h,qPCR檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)促炎因子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS刺激可促進(jìn)Tim-4敲除BMDM促炎分子iNOS、TNF-α、IL-1β的表達(dá),而NF-κB通路抑制劑組則可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。另外,兩組BMDM分別進(jìn)行LPS或IL-4刺激,并加入DMSO或NF-κB通路抑制劑處理,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS刺激后Tim-4-/-組BMDM中M1型比例顯著上調(diào),IL-4刺激后M2型比例下調(diào),而NF-κB通路抑制劑組中則未發(fā)現(xiàn)明顯差異。以上結(jié)果證實(shí),Tim-4通過(guò)NF-κB通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化。5.Tim-4調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在肥胖中的作用5.1 Tim-4敲除的巨噬細(xì)胞對(duì)脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱功能、米色化的影響為了進(jìn)一步明確Tim-4對(duì)脂肪細(xì)胞能量代謝的影響,將3T3-L1細(xì)胞系誘導(dǎo)為成熟的脂肪細(xì)胞,分別與IL-4刺激的Tim-4-/-與WT小鼠的BMDM共培養(yǎng)24h,然后檢測(cè)兩組巨噬細(xì)胞對(duì)脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱功能及米色化相關(guān)標(biāo)記分子的影響。利用qPCR技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)后脂肪細(xì)胞中UCP-1、Ear2、Tmem26及CD137的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Tim-4敲除的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞表達(dá)上述分子顯著降低,說(shuō)明巨噬細(xì)胞敲除Tim-4后可抑制脂肪細(xì)胞的產(chǎn)熱功能以及向米色脂肪的轉(zhuǎn)化。5.2 Tim-4敲除的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)輸對(duì)肥胖進(jìn)程的影響為了明確Tim-4調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在肥胖進(jìn)程的具體作用,在HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中進(jìn)行了ATMs轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)。首先,利用WT小鼠進(jìn)行高脂飼喂10周后,分別通過(guò)F4/80+磁珠分選純化正常飲食WT及Tim-4-/-小鼠的ATMs,經(jīng)腹腔注射轉(zhuǎn)輸?shù)礁咧桂B(yǎng)的WT小鼠,每隔4天轉(zhuǎn)輸1次,共轉(zhuǎn)輸6次。GTT及ITT結(jié)果顯示,Tim-4KO-ATMs轉(zhuǎn)輸組小鼠糖耐量減弱,胰島素抵抗無(wú)明顯差異,Tim-4KO-ATMs轉(zhuǎn)輸組較WT-ATMs組附睪脂肪重量較高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外,檢測(cè)了血清中胰島素、脂聯(lián)素、TG、TC的水平,結(jié)果顯示,Tim-4KO-ATMs轉(zhuǎn)輸組小鼠血清中胰島素及TG的水平明顯升高,其余指標(biāo)無(wú)明顯差異。為了明確Tim-4是否通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的米色化增強(qiáng)能量代謝,qPCR檢測(cè)了脂肪組織中產(chǎn)熱功能及米色化相關(guān)標(biāo)記分子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tim-4KO-ATMs組小鼠附睪脂肪內(nèi)低表達(dá)UCP-1、Ear2和Tmem26。最后,為了明確巨噬細(xì)胞Tim-4對(duì)脂肪組織內(nèi)炎性因子表達(dá)的影響,qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tim-4KO-ATMs轉(zhuǎn)輸組小鼠附睪脂肪內(nèi)高表達(dá)促炎因子TNF-α及IL-6,而抑炎分子Argl、Retnla的表達(dá)則較低。以上結(jié)果表明,Tim-4可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞促炎功能,影響脂肪組織的代謝水平,進(jìn)而干預(yù)肥胖進(jìn)程。綜上,本課題首次研究了Tim-4在肥胖中的表達(dá)變化,明確了 Tim-4在肥胖發(fā)生發(fā)展中的作用,并證明了 Tim-4分子通過(guò)NF-κB通路調(diào)控巨噬細(xì)胞功能抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖,為肥胖的干預(yù)提供新的潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

ｍ圖１肥胖脂肪組織中Ｔｉｍ－４的表達(dá)升高逡逑Ａ．ｑＰＣＲ檢測(cè)高脂小鼠及ｄｂ／ｄｂ小鼠脂肪組織中Ｔｉｍ－４邋ｍＲＮＡ的表達(dá)；Ｂ．Ｗｅｓｔｅｍ逡逑Ｂｌｏｔ檢測(cè)高脂及ｄｂ／ｄｂ小鼠脂肪組織中Ｔｉｍ－４蛋白的表達(dá)。逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ邋Ｅｎｈａｎｃｅｄ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｔｉｍ－４邋ｉｎ邋ａｄｉｐｏｓｅ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｆｒｏｍ邋ｏｂｅｓｅ邋ｍｉｃｅ．逡逑

圖２肥胖脂肪組織ＳＶＦｓ中Ｔｉｍ－４的表達(dá)升氋逡逑Ａ．ｑＰＣＲ檢測(cè)ｄｂ／ｄｂ小鼠ＳＶＦｓ中的Ｔｉｍ－４邋ｍＲＮＡ的表達(dá)；Ｂ？流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ｄｂ／ｄｂ逡逑小鼠ＡＴＭｓ中Ｔｉｍ－４的表達(dá)；Ｃ．免疫熒光檢測(cè)ｄｂ／ｄｂ小鼠脂肪組織ＡＴＭｓ中Ｔｉｍ－４逡逑的表達(dá)。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R589.2

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本文編號(hào)：2670244