【摘要】：【目的】:通過(guò)提高脂肪細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)O-GlcNAc水平,探索細(xì)胞內(nèi)脂聯(lián)素水平變化,以及細(xì)胞胰島素敏感性及糖脂代謝的變化情況。【方法】:以3T3-L1成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,應(yīng)用傳統(tǒng)的雞尾酒法誘導(dǎo)其成脂分化為成熟的脂肪細(xì)胞,在誘導(dǎo)分化的第10天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行油紅染色鑒定脂肪細(xì)胞是否分化成熟。(1)分化成熟的脂肪細(xì)胞隨機(jī)分為兩組,每組至少重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組給予含有100umol/L的O-GlcNAc修飾的關(guān)鍵酶O-GlcNAcase(OGA)的抑制劑PUGNAc的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,對(duì)照組僅以不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),16小時(shí)后,取細(xì)胞上清液測(cè)剩余葡萄糖濃度;用預(yù)先加入了PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定細(xì)胞提取物中總蛋白質(zhì)的濃度,Western Blotting法測(cè)定細(xì)胞細(xì)胞中蛋白質(zhì)的O-GlcNAc修飾的水平,糖基化修飾相關(guān)OGA、OGT水平以及總脂聯(lián)素、高聚體脂聯(lián)素(HMW)、p-AMPK/AMPK水平和p-Akt/Akt水平。(2)完成PUGNAc干預(yù)培養(yǎng)或空白對(duì)照培養(yǎng)16小時(shí)后,兩組用無(wú)菌PBS緩沖液輕輕漂洗細(xì)胞兩次,然后均給予含有10nmol/L的胰島素、葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),1小時(shí)后提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用生化分析法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中剩余葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、總膽固醇(Chol)及甘油三酯(TG)的水平;Western blotting法檢測(cè)蛋白提取物中p-Akt/Akt水平。用脂滴特異性熒光染色劑Bodipy對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行染色,熒光免疫試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-AMPK水平,熒光顯微鏡下觀察�！窘Y(jié)果】:結(jié)果顯示:(1)成功誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。分化后細(xì)胞分為兩組進(jìn)行藥物PUGNAc干預(yù)和空白對(duì)照。(1)經(jīng)Western blotting檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,PUGNAc處理組的3T3-L1脂肪細(xì)胞,其總蛋白質(zhì)O-GlcNAc水平明顯升高(P0.05),同時(shí)伴隨OGA的水平也升高(p0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而蛋白質(zhì)OGT水平無(wú)明顯變化(P0.05);(2)檢測(cè)胰島素處理前、后細(xì)胞上清液剩余葡萄糖濃度,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PUGNAc處理組細(xì)胞上清液剩余葡萄糖濃度均較高,其葡萄糖攝取率較對(duì)照組均較低(葡萄糖攝取率等于培養(yǎng)初始時(shí)葡萄糖濃度減去培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)剩余葡萄糖濃度)(P0.05);而其細(xì)胞上清中LDL-C水平較對(duì)照組升高(P0.05),兩組之間對(duì)比,差異有意義,脂肪細(xì)胞熒光染料Bodipy染色示PUGNAc組脂肪細(xì)胞外脂滴增大增多;(3)PUGNAc處理組其細(xì)胞總脂聯(lián)素(APN)水平較對(duì)照組高,但高聚體脂聯(lián)素(HMW)水平較對(duì)照組低,HMW/總APN比例下降;P值均0.05,差異有意義;(4)O-GlaNAc水平升高,P-AMPK水平下降,P-AMPK/AMPK比例下降(P0.05)。未經(jīng)胰島素刺激情況下,兩組p-Akt/Akt水平無(wú)明顯變化(P0.05);經(jīng)胰島素刺激后,PUGNAc處理組p-Akt/Akt水平較對(duì)照組下降(p0.05)�！窘Y(jié)論】脂肪細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾水平升高,細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性降低,糖脂代謝功能紊亂,可能與高聚體脂聯(lián)素水平下降有關(guān)。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化第 10 天，脂肪細(xì)胞經(jīng)油紅染色鑒定細(xì)胞是否分化完全。如圖 1（a）所示，未分化的前體細(xì)胞顯微鏡下放大 200 倍呈不規(guī)則纖維狀，細(xì)胞貼壁緊密；如（b）所示，脂肪細(xì)胞經(jīng)分化完成后，油紅染色鏡下可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)為圓形或近似圓形，細(xì)胞周圍可見(jiàn)紅色脂滴包繞，，表明細(xì)胞分化完全。

3.表示兩組細(xì)胞在含胰島素培養(yǎng)基的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1 小時(shí)后細(xì)胞上清脂類的含量，*表示與對(duì)照組相比 P<0.05,n=3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（a）表示組上清液 TG 的比較，（b）表示兩組之間 LDL-C 水平比較。（c）、（d）分別表示組之間 HDL-C、TC 的水平比較。.脂滴熒光染料 Bodipy 染色顯示細(xì)胞外脂滴大小。高聚體脂聯(lián)素能夠促進(jìn)脂質(zhì)分解，防止脂質(zhì)沉積。通過(guò) Bodipy 染色了解脂細(xì)胞外脂滴堆積情況。如圖所示，PUGNAc 處理脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解減弱，脂滴積大，呈圓形密集堆積，而對(duì)照組脂滴體積小，脂質(zhì)堆積少。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R589

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2659231