【摘要】：亨廷頓蛋白相關(guān)蛋白1(huntingtin associated protein1, HAP1)是第一個被發(fā)現(xiàn)的能與亨廷頓病基因產(chǎn)物亨廷頓蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì),在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。在大鼠和小鼠中,HAP1具有HAP1A和HAP1B兩種亞型,二者區(qū)別在于羧基末端氨基酸序列不同。在人腦內(nèi),HAP1只有一種,其序列與大鼠的HAP1A相似。HAP1基因敲除小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)退行性變化,并表現(xiàn)出生長發(fā)育和攝食障礙,且多在出生后2-3天內(nèi)死亡,表明HAP1是一種十分重要的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元內(nèi)的HAP1是一種連接微管馬達(dá)蛋白與被轉(zhuǎn)運(yùn)物的銜接蛋白或相關(guān)蛋白,參與胞內(nèi)運(yùn)輸。 除了在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)外,HAP1在包括胰島β細(xì)胞在內(nèi)的分泌含氮激素的內(nèi)分泌細(xì)胞中也表達(dá)。胰島β細(xì)胞內(nèi)的HAP1參與高糖刺激后的胰島素分泌。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明,HAP1可以作為胰島β細(xì)胞內(nèi)微管依賴性馬達(dá)蛋白及其相關(guān)蛋白p150、KLC和KIF5B與胰島素分泌顆粒的連接蛋白,參與調(diào)控胰島素分泌顆粒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微管依賴性長距離運(yùn)輸。然而,胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜募集的微絲(microfilament)或肌動蛋白絲(actin filament)依賴性運(yùn)輸是肌球蛋白5a (myosin Va)介導(dǎo)的,是否胰島β細(xì)胞內(nèi)的HAP1也可以作為肌球蛋白5a與胰島素分泌顆粒的連接蛋白,參與胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜募集的微絲依賴性運(yùn)輸,進(jìn)而影響胰島素的分泌,目前未見報道。 因此,本研究將探討HAP1是否參與胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌顆粒的微絲依賴性募集運(yùn)輸,分析β細(xì)胞內(nèi)HAP1與微絲馬達(dá)蛋白肌球蛋白5a的關(guān)系,證明HAP1能否作為肌球蛋白5a與胰島素分泌顆粒間的銜接蛋白,參與胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜募集的微絲依賴性運(yùn)輸,從而揭示HAP1影響胰島素分泌的機(jī)制。 1. HAP1與胰島素、肌球蛋白5a和肌動蛋白在β細(xì)胞內(nèi)共存如果HAP1參與胰島素分泌顆粒的微絲依賴性運(yùn)輸,那么在空間上HAP1應(yīng)與分泌顆粒及參與分泌顆粒微絲依賴性運(yùn)輸?shù)鸟R達(dá)蛋白肌球蛋白5a之間具有密切關(guān)系。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡,聯(lián)合免疫熒光雙標(biāo)技術(shù),我們觀察到HAP1在INS-1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(包括細(xì)胞突起)內(nèi)呈點(diǎn)狀分布,與胰島素顆粒具有共定位,且在細(xì)胞膜附近二者的共定位尤為明顯。同時,免疫熒光雙標(biāo)的單細(xì)胞三維重建分析表明,HAP1與胰島素在INS-1細(xì)胞內(nèi)的共定位是真實(shí)可靠的,避免了因空間構(gòu)象造成的假象；HAP1與肌球蛋白5a和肌動蛋白及肌球蛋白5a與肌動蛋白在INS-1細(xì)胞內(nèi)也分別具有共定位關(guān)系。HAP1與胰島素顆粒、肌球蛋白5a、肌動蛋白之間的定位關(guān)系提示,HAP1可能通過與胰島素顆粒、肌球蛋白5a之間的相互作用參與胰島素分泌顆粒的微絲依賴性運(yùn)輸。 2.HAP1A與胰島素分泌顆粒在細(xì)胞膜附近共同遷移HAP1A和HAP1B的區(qū)別在于二者C末端的氨基酸序列不同。為了進(jìn)一步明確這兩個亞型在胰島素分泌顆粒的微絲依賴性運(yùn)輸中的作用,我們在INS-1細(xì)胞內(nèi)瞬時共轉(zhuǎn)了HAP1A-DsRed或pJRed-HAP1B與胰島素分泌顆粒特征性膜蛋白phogrin-EGFP。激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示：HAP1A-DsRed在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈點(diǎn)狀分布,并與phogrin-EGFP存在廣泛的共定位。從時間序列延時掃描獲得的動態(tài)圖像顯示HAP1A-DsRed與phogrin-EGFP在細(xì)胞膜附近共同遷移。相反,活細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)pJRed-HAP1B在p細(xì)胞內(nèi)沒有明顯運(yùn)動,呈彌散狀態(tài)分布在整個細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。為了排除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量及其所攜帶熒光標(biāo)簽對HAP1B蛋白表達(dá)的定位影響,我們用攜帶不同熒光的HAP1B在不同轉(zhuǎn)染劑量下對結(jié)果進(jìn)行重復(fù),得到了HAP1B在細(xì)胞內(nèi)確實(shí)是彌散分布的相同結(jié)論。這些結(jié)果表明,HAP1A亞型可能比HAP1B亞型在胰島素分泌顆粒的運(yùn)動中發(fā)揮更加重要的作用。 3.沉默HAP1抑制高糖刺激后胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜的募集為了為HAP1參與胰島素或胰島素分泌顆粒的微絲依賴性運(yùn)輸提供直接證據(jù),觀察了沉默胰島β細(xì)胞系內(nèi)HAP1表達(dá)水平對胰島素分泌顆粒在細(xì)胞膜附近的定位分布和運(yùn)輸特性的影響：轉(zhuǎn)染phogrin-EGFP質(zhì)粒對INS-1細(xì)胞內(nèi)的胰島素分泌顆粒進(jìn)行靶向標(biāo)記,采用siRNA沉默內(nèi)源性的HAP1,在激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)和全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)下觀察沉默HAP1后高糖刺激引起的胰島素分泌顆粒在細(xì)胞膜附近的定位分布與胞內(nèi)運(yùn)輸變化。 LSCM下觀察發(fā)現(xiàn),INS-1細(xì)胞瞬時共轉(zhuǎn)HAP1SiRNA質(zhì)�；�?qū)φ?scramble)質(zhì)粒與phogrin-EGFP后,先用低糖(1mmol/L)孵育1h,再用高糖(20mmol/L)刺激10min,與scramble組比較,siRNA組的胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜的募集明顯減少。對細(xì)胞膜區(qū)域和整個細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的胰島素分泌顆粒phogrin-EGFP的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量,計算胞膜/胞質(zhì)的比值顯示,siRNA組胰島素分泌顆粒熒光強(qiáng)度的胞膜/胞質(zhì)的比例顯著低于對照組。 TIRFM能有效地觀察動態(tài)范圍在200nm以內(nèi)的熒光標(biāo)記細(xì)胞表面物質(zhì)的運(yùn)動,特別適合動態(tài)分析活細(xì)胞分泌顆粒向細(xì)胞膜的募集事件。用phogrin-EGFP與HAP1siRNA質(zhì)�；騭cramble質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞后,先低糖孵育1h,再高糖刺激10min,用TIRFM記錄刺激前和刺激后的圖像,對刺激前后單位面積內(nèi)phogrin-EGFP標(biāo)記的分泌顆粒分別進(jìn)行計數(shù),結(jié)果顯示,高糖刺激后,siRNA組向細(xì)胞膜募集的胰島素分泌顆粒數(shù)目顯著低于scramble組。 LSCM和TIRFM觀察結(jié)果表明,HAP1可調(diào)控胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜的募集運(yùn)輸。 4. HAP1介導(dǎo)肌球蛋白5a與胰島素分泌顆粒之間的相互作用為了明確HAP1是否通過介導(dǎo)肌球蛋白5a與胰島素分泌顆粒之間的相互作用影響后者向細(xì)胞膜募集的微絲依賴性運(yùn)輸,首先應(yīng)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了HAP1與肌球蛋白5a和胰島素分泌顆粒之間具有相互作用。對用siRNA沉默HAP1的INS-1細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn),沉默HAP1可顯著減弱肌球蛋白5a與胰島素分泌顆粒特征性膜蛋白phogrin之間的結(jié)合能力,由此表明HAP1可作為胰島β細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白5a與胰島素分泌顆粒之間的連接蛋白介導(dǎo)二者之間的相互作用,沉默HAP1導(dǎo)致高糖刺激后胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜的微絲依賴性募集減少可能是因?yàn)榧∏虻鞍?a與分泌顆粒之間的結(jié)合能力減弱所致。 5.高糖刺激增強(qiáng)HAP1與肌球蛋白5a之間的相互作用并與HAP1A去磷酸化相關(guān)為了明確HAP1參與胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜募集運(yùn)輸?shù)淖饔檬欠衽c其和肌球蛋白5a的結(jié)合力增強(qiáng)有關(guān),應(yīng)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測了高糖刺激對INS-1細(xì)胞內(nèi)HAP1與肌球蛋白5a結(jié)合特性的影響。結(jié)果顯示,高糖刺激INS-1細(xì)胞后,HAP1與肌球蛋白5a的結(jié)合能力明顯增強(qiáng)。 在神經(jīng)細(xì)胞中,HAP1A的磷酸化能減弱其與微管馬達(dá)蛋白相關(guān)蛋白p150和KLC的結(jié)合,胞內(nèi)運(yùn)輸因此受到抑制,而HAP1去磷酸化則相反；在胰島p細(xì)胞內(nèi),高糖刺激能增強(qiáng)HAP1與p150和KLC的結(jié)合,但HAP1A的磷酸化程度減弱。為了明確HAP1與肌球蛋白5a的結(jié)合能力在高糖刺激后的增強(qiáng)是否與HAP1A的磷酸化減弱有關(guān),本研究進(jìn)一步分析了去磷酸化突變型HAP1A(T598A)與肌球蛋白5a的結(jié)合能力。用丙氨酸(alamine, A)替換HAP1A的羧基末端PKA磷酸化位點(diǎn)第598位的蘇氨酸(threonine, T),構(gòu)建表達(dá)綠色熒光EGFP的野生型HAP1A (EGFP-HAP1A)和突變型T598A (EGFP-T598A),轉(zhuǎn)染至INS-1細(xì)胞內(nèi)后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,去磷酸化的HAP1A(T598A)比野生型HAP1A能結(jié)合更多肌球蛋白5a,提示高糖刺激增強(qiáng)HAP1與肌球蛋白5a之間的相互作用并與HAP1A去磷酸化相關(guān)。 結(jié)論本研究證明HAP1可以作為胰島β細(xì)胞內(nèi)微絲依賴性馬達(dá)蛋白肌球蛋白5a與胰島素分泌顆粒之間的連接蛋白,調(diào)控胰島素分泌顆粒向細(xì)胞膜的微絲依賴性募集運(yùn)輸。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

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本文編號：2655715