發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 17:54

【摘要】：研究背景:強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spongdylitis,AS)是一種以累及中軸關(guān)節(jié)為主的慢性進(jìn)行性炎性疾病。炎癥是AS最為突出的疾病特征,是造成AS患者病程過程中新骨形成、脊柱強(qiáng)直畸形最根本的病理因素。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是一類長度大于200個(gè)核苷酸、幾乎不能編碼蛋白的功能性RNA分子。大量研究已經(jīng)證實(shí)lnc RNA能夠參與多種炎性疾病的免疫炎癥調(diào)節(jié),甚至某些lnc RNA可作為疾病診斷的標(biāo)志物。目前,lnc RNAs在AS發(fā)病中的作用鮮有報(bào)道,lnc RNAs在不同疾病活動(dòng)度AS患者的表達(dá)情況以及l(fā)nc RNA是否可作為AS疾病活動(dòng)評(píng)判甚至AS早期診斷的標(biāo)志物尚不清楚。目的:了解不同疾病活動(dòng)分期AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)lnc RNAs和m RNAs的表達(dá)情況,初步探討lnc RNAs作為診斷AS及評(píng)估病情活動(dòng)的生物標(biāo)志物的可能。方法:1.收集活動(dòng)期AS(AAS:BASDAI≥6,或6BASDAI4且ESR22mm/h,或6BASDAI4且hs CRP9mg/L)患者、穩(wěn)定期AS(IAS:BASDAI≤4)患者及健康體檢者(HC)外周血各3例并分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),提取總RNA,基因芯片檢測三組lnc RNAs和m RNAs表達(dá)譜;隨機(jī)選擇7個(gè)差異表達(dá)的lnc RNAs,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-q PCR)驗(yàn)證其芯片結(jié)果;進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的m RNAs進(jìn)行GO及KEGG等生物信息學(xué)分析。2.(1)在7個(gè)已經(jīng)驗(yàn)證的lnc RNAs中篩選出疾病組與對(duì)照組之間有差異表達(dá)而疾病亞組之間無差異的4個(gè)lnc RNAs(NR_037662,ENST00000599316,ENST00000577914和ENST00000579003);(2)收集AAS、IAS及HC外周血各30例并提取PBMCs,同時(shí)收集臨床資料,RT-q PCR檢測4個(gè)lnc RNAs在三組的表達(dá)情況;(3)采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)組間比較4個(gè)lnc RNAs在三組的表達(dá)差異;并采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析其診斷AS的效能,其中ROC曲線下面積(area under the curve,AUC)在0.7~0.9之間,提示該指標(biāo)具有一定診斷價(jià)值,當(dāng)AUC大于0.9時(shí),則說明診斷價(jià)值較高。3.(1)在7個(gè)已經(jīng)驗(yàn)證的lnc RNAs中篩選出在AS不同疾病活動(dòng)度有差異表達(dá)的3個(gè)lnc RNAs(NR_003542,ENST00000512051和NR_026756);(2)收集AAS、IAS及HC外周血各30例并提取PBMCs,同時(shí)收集臨床資料,RT-q PCR檢測3個(gè)lnc RNAs在三組的表達(dá)情況;ELISA檢測三組血漿高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá)水平;(3)采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)組間比較3個(gè)lnc RNAs及HMGB1在三組的表達(dá)差異,采用Spearman相關(guān)性分析lnc RNAs與AS患者臨床指標(biāo)及HMGB1之間的相關(guān)性。結(jié)果:1.基因芯片結(jié)果:(1)與HC組比較,AAS組和IAS組分別有2967個(gè)和3137個(gè)差異表達(dá)的lnc RNAs,1597個(gè)和2953個(gè)差異表達(dá)的m RNAs;與IAS組比較,AAS組差異表達(dá)2190個(gè)lnc RNAs和1252個(gè)m RNAs;(2)RT-q PCR驗(yàn)證7個(gè)lnc RNAs的表達(dá)趨勢與基因芯片結(jié)果一致;(3)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與AS免疫炎癥相關(guān)的生物學(xué)過程。2.(1)NR_037662和ENST00000599316在AAS及IAS組的表達(dá)均顯著高于HC組[NR_037662:1.40(1.42)×10-4vs1.53(1.60)×10-4 vs0.72(0.46)×10-4,ENST00000599316:5.43(4.72)×10-3 vs8.10(6.45)×10-3 vs3.06(2.26)×10-3;P均0.001],在AAS與IAS組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而ENST00000577914和ENST00000579003在AAS組與IAS組的表達(dá)則顯著低于HC組[ENST00000577914:3.06(5.15)×10-5 vs2.86(2.04)×10-5vs4.61(5.77)×10-5;ENST00000579003:1.54(2.42)×10-3vs 2.36(3.85)×10-3vs3.15(3.43)×10-3;P均0.05],在AAS與IAS組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(2)ROC曲線分析結(jié)果示NR_037662、ENST00000599316、ENST00000577914和ENST00000579003的AUC依次為0.804、0.812、0.706和0.698。3.(1)NR_003542和ENST00000512051在AAS組顯著高于IAS組和HC組[NR_003542:1.33(1.54)×10-2vs1.02(0.99)×10-2vs 1.03(0.34)×10-2,ENST00000512051:1.45(1.29)×10-2 vs0.96(1.06)×10-2vs 1.02(0.64)×10-2,P均0.05],IAS組和HC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而NR_026756表達(dá)水平在AAS組顯著低于IAS組和HC組[0.15(0.58)×10-3 vs0.50(0.95)×10-3 vs 0.61(0.91)×10-3,P均0.05],在AS組和HC組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(2)血漿HMGB1表達(dá)水平在AAS組高于IAS組和HC組(162.27±172.40ng/ml vs 79.62±40.84ng/ml vs 41.94±25.19ng/ml,P均0.01),且在IAS組顯著高于HC組(P0.01)。(3)NR_003542的表達(dá)水平與BASFI、ESR、hs CRP呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P均0.05);NR_026756的表達(dá)水平與BASDAI、BASFI、ESR、hs CRP、GLOB以及血漿HMGB1水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P均0.05);ENST00000512051與各臨床指標(biāo)無明顯相關(guān)性(P0.05)。結(jié)論:1.lnc RNA和m RNA在AS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的芯片表達(dá)差異提示其可能參與AS的發(fā)生發(fā)展,進(jìn)一步生物信息學(xué)提示差異基因主要參與AS的免疫炎癥反應(yīng)過程;2.lnc RNA-NR_037662、ENST00000599316和ENST00000577914在AS中異常表達(dá),提示其可能參與AS發(fā)病,有望作為診斷AS的生物標(biāo)志物;3.lnc RNA-NR_003542和NR_026756可能參與AS炎癥調(diào)節(jié),有望作為評(píng)估AS病情活動(dòng)度的生物標(biāo)志物。
【圖文】：

芯片樣本RNA電泳圖（條帶1-3:AAS;條帶4-6:IAS;條帶7-9:HC）

例樣本lncRNAs表達(dá)譜芯片掃描圖
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R593.23

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