【摘要】：目的:通過觀察ApoM-S1P對(duì)小鼠肝臟糖代謝及相關(guān)信號(hào)通路的影響和ApoM基因表達(dá)下調(diào)對(duì)腎小球系膜細(xì)胞凋亡水平的改變,進(jìn)而初步探究ApoM與糖代謝及2型糖尿病之間的潛在關(guān)聯(lián)性。方法:利用ApoM基因缺失型小鼠和肝細(xì)胞模型、ApoM基因過表達(dá)小鼠肝細(xì)胞模型、ApoM基因表達(dá)受干擾小鼠腎小球系膜細(xì)胞模型。通過糖刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ApoM基因缺失對(duì)葡萄糖代謝的影響;利用qPCR和Western-blot分別檢測(cè)ApoM基因缺失后肝臟糖代謝相關(guān)酶和胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化;通過Western-blot檢測(cè)ApoM基因過表達(dá)后肝細(xì)胞中糖代謝相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的變化情況;采用Western-blot檢測(cè)加入S1P生物活性制劑后對(duì)ApoM缺失型肝細(xì)胞糖代謝相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響;通過透射電子顯微鏡觀察ApoM基因缺失后小鼠腎臟的形態(tài)變化;通過Western-blot、DAPI染色以及細(xì)胞流式術(shù)觀察ApoM表達(dá)下調(diào)對(duì)小鼠腎臟凋亡水平的影響。結(jié)果:1.葡萄糖含量的持續(xù)上升下調(diào)了小鼠肝細(xì)胞AML12中ApoM的表達(dá)水平(P0.05)。2.經(jīng)不同濃度葡萄糖刺激24小時(shí)后,ApoM基因缺失的AML12細(xì)胞培養(yǎng)液中糖濃度相較于正常對(duì)照組升高(P0.05)。3.ApoM基因缺失后,小鼠肝臟組織和肝細(xì)胞中糖異生關(guān)鍵酶G6PC的mRNA水平增高(P0.05)。4.ApoM基因缺失后小鼠肝細(xì)胞AML12中Akt、GSK3β、AS160以及AMPKα的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比無顯著差異(P0.05)。而p-AKT ser473、p-GSK3βser9、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表達(dá)水平相較于正常對(duì)照組均顯著下降(P0.05),提示ApoM基因的缺失導(dǎo)致小鼠中葡萄糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂。5.使用AdEasy重組腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建過表達(dá)ApoM基因的小鼠肝細(xì)胞模型。6.在ApoM基因缺失的小鼠肝細(xì)胞AML12中重新過表達(dá)ApoM,p-GSK3βser9、p-As160 ser588重新恢復(fù)到與正常細(xì)胞接近的水平。7.在ApoM基因缺失的肝細(xì)胞中加入S1P,導(dǎo)致原先表達(dá)水平下調(diào)的p-AKT ser473、p-GSK3βser9、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05),基本與正常細(xì)胞一致。8.在體水平ApoM基因的缺失導(dǎo)致S1PR1、S1PR3、S1PR4以及S1PR5的mRNA水平顯著下降(P0.05),S1PR2的mRNA水平改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。離體水平與在體水平結(jié)果基本一致。9.使用S1PR1與S1PR3的抑制劑VPC23019孵育正常小鼠肝細(xì)胞AML12,p-AKT ser473、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。使用S1PR2抑制劑JTE013,p-AKT ser473、p-As160 ser588以及p-AMPKαThr172的表達(dá)水平無明顯改變。10.ApoM基因缺失小鼠腎臟的線粒體出現(xiàn)外室腫脹、空泡化以及髓樣變,并且大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常擴(kuò)張。抑制ApoM基因表達(dá)的系膜細(xì)胞增殖減少,細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、核固縮以及核裂解。11.ApoM基因表達(dá)受抑制導(dǎo)致小鼠腎臟及腎小球系膜細(xì)胞中AIF、Bax、chop、p-JNK、clever-caspase9、clever-caspase12、clever-caspase7以及clever-caspase3的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05),Bcl2的表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。提示ApoM表達(dá)水平的下降通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑上調(diào)小鼠腎臟及腎小球系膜細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)論:1.ApoM基因的缺失導(dǎo)致小鼠肝臟糖代謝異常及相關(guān)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。2.ApoM可能通過S1P/S1PR1/S1PR3調(diào)節(jié)小鼠肝臟糖代謝相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.ApoM表達(dá)水平的下調(diào)通過線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑上調(diào)小鼠腎臟及腎小球系膜細(xì)胞的凋亡水平。
【圖文】：

但當(dāng)加入的葡萄糖濃度達(dá)到 15mM 時(shí) ApoM 的表達(dá)水平顯著下降（P<0.03，圖1-1B）。圖 1-1 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下各組 AML12 細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及 ApoM 的表達(dá)水平（A）20 倍鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，各組 AML12 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變;（B）利用 WB 檢測(cè) AML12 細(xì)胞在不同糖濃度刺激下 ApoM 的表達(dá)水平。**p<0.03。Fig. 1-1 Morphological structure and ApoM expression levels of AML12 cells in different

) The morphological structure of each group was observed under the microscope at 20mes. The morphological structure of AML12 cells in each group did not changegnificantly; (B) The expression level of ApoM in AML12 cells stimulated by different sugaroncentrations was detected by WB. **p<0.03. 高糖環(huán)境中 ApoM 基因缺失的肝細(xì)胞培液中葡萄糖含量增多在 AML12-GFP 與 AML12-ApoM-/-細(xì)胞完全培養(yǎng)液中分別加入 1 mM、2M、5 mM、10 mM 以及 15 mM 濃度的葡萄糖并孵育 24 小時(shí)，，利用葡萄糖檢試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中糖濃度。如圖 1-2 所示，在 5 mM 到 10 mM 濃度的葡萄刺激 24 小時(shí)，AML12-ApoM-/-組細(xì)胞培養(yǎng)液中的糖濃度明顯高于 AML12-GFP（Glucose 5 mM，P<0.01；10 mM，P<0.03）。上述兩個(gè) ApoM 與高糖之間的向?qū)嶒?yàn)提示 ApoM 與糖代謝之間關(guān)系密切。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.1

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