【摘要】：空氣污染物中的環(huán)境顆粒物(Particulate Matter,PM),特別是細(xì)顆粒物(Fine Particulate Matter,PM2.5),已成為許多國家,特別是中國北方地區(qū)最嚴(yán)重的環(huán)境和公共衛(wèi)生問題之一。PM是一種來源復(fù)雜、構(gòu)成復(fù)雜的混合物。PM2.5因其粒徑小、比表面積大、含有大量的有毒、有害物質(zhì),并可以穿過細(xì)支氣管到達(dá)肺泡甚至進(jìn)入血液,而被認(rèn)為是對(duì)肺部最有害的顆粒物。石家莊市作為京津冀地區(qū)的大城市之一,受交通相關(guān)污染、鋼鐵、水泥、冬季取暖等多重污染因素的影響,城區(qū)污染水平居于全國前列,并在中國190個(gè)城市因?yàn)轭w粒物污染造成的疾病負(fù)擔(dān)中居于第五位,占大氣污染相關(guān)死亡總?cè)藬?shù)的2.02%。支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種異質(zhì)性疾病,通常以慢性氣道炎癥為特征,以氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness,AHR)為病理生理特點(diǎn)。其發(fā)生和發(fā)展與暴露于外部介質(zhì)(例如,上呼吸道病毒、塵螨和空氣污染物等)有關(guān)。既往的流行病學(xué)調(diào)查表明,PM2.5暴露與哮喘的發(fā)病率、住院率、死亡率增加相關(guān)。目前在臨床方面進(jìn)行的PM2.5對(duì)哮喘患者的影響,主要集中在流行病學(xué)調(diào)查,與哮喘患者肺功能的直接相關(guān)性的研究較少。既往的PM2.5對(duì)哮喘患者肺功能的影響主要側(cè)重在暴露時(shí)間內(nèi)污染物平均濃度相對(duì)哮喘癥狀和肺功能的影響,缺乏點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的PM2.5與哮喘患者每日肺功能變化的相關(guān)性的研究。在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方面,缺乏模擬真實(shí)世界的PM2.5慢性暴露的動(dòng)物模型,并且對(duì)于PM2.5慢性暴露是否加重氣道高反應(yīng)性、其致病機(jī)理如何均有待進(jìn)一步研究。我們的研究分為兩部分:第一部分為臨床部分,觀察短期暴露情況下石家莊市區(qū)內(nèi)的每日大氣污染物(含PM2.5和刺激性氣體)指標(biāo)與哮喘患者肺功能的相關(guān)性。研究涉及到不同個(gè)體連續(xù)監(jiān)測的肺功能數(shù)據(jù)與連續(xù)的大氣污染物數(shù)據(jù),選用多水平混合效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并對(duì)PM2.5進(jìn)行滯后效應(yīng)分析,較以往的研究更為精準(zhǔn)全面。第二部分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分。我們采用PM2.5多功能氣溶膠濃縮富集系統(tǒng)對(duì)不同組小鼠進(jìn)行為期8周的吸入暴露,觀察對(duì)于卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏的小鼠的氣道高反應(yīng)性影響,并研究凋亡及T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白域1(T-cell immunoglobulin and mucin domain 1,TIM-1)在這個(gè)過程中的作用。第一部分細(xì)顆粒物對(duì)支氣管哮喘患者肺功能的影響:短期暴露研究目的:觀察短期暴露期間的每日空氣污染物(包括細(xì)顆粒物和SO_2、NO_2、O_3)變化對(duì)于哮喘患者肺功能的影響。方法:采用觀察性研究的方法,在2018年2月-2019年3月期間募集居住于石家莊市城區(qū)的支氣管哮喘慢性持續(xù)期控制狀態(tài)的患者,排除其他系統(tǒng)疾病后安排入組�；�期入組時(shí)記錄其一般情況,核實(shí)臨床診斷依據(jù)等。入組后發(fā)放肺功能儀記錄患者每日最大呼氣流速(peak expiratory flow,PEF),用力肺容積(Forced vital capacity,FVC),FVC占預(yù)計(jì)值百分比(FVC%),第一秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in one second,FEV1),FEV1占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%),一秒率(FEV1/FVC),及反應(yīng)小氣道情況的75%用力呼氣流速(Maximal expiratory flow at 75%,MEF75),50%用力呼氣流速(Maximal expiratory flow at 50%,MEF50),25%用力呼氣流速(Maximal expiratory flow at 25%,MEF25),連續(xù)監(jiān)測10天,測試結(jié)果自動(dòng)上傳儲(chǔ)存。同時(shí)自石家莊市環(huán)保局獲得相應(yīng)日期的大氣細(xì)顆粒物及有毒氣體(包括SO_2、NO_2、O_3)情況。匯總所得數(shù)據(jù)采用多水平混合效應(yīng)分析模型構(gòu)建統(tǒng)計(jì)模型,分別對(duì)每日PM2.5固體顆粒物和SO_2、NO_2、O_3三種刺激性氣體對(duì)哮喘患者每日肺功能的影響進(jìn)行單因素分析,并對(duì)PM2.5進(jìn)行滯后效應(yīng)分析,根據(jù)單因素分析結(jié)果再進(jìn)行多因素分析。結(jié)果:1.入組42名患者,其中男性14名,女性28名,男女兩組患者之間BMI值,用藥劑量等級(jí)等無明顯差異。2.PM2.5固體污染物單因素(含滯后)的混合效應(yīng)模型固定效應(yīng)估計(jì)結(jié)果顯示:PM2.5的0階滯后值與肺功能參數(shù)值PEF(z=-2.28,P=0.023)、FVC(z=-2.51,P=0.012)、FEV1%(z=-2.18,P=0.029)、FEV1(z=-2.21,P=0.027)的變異呈負(fù)相關(guān)。PM2.5的1階滯后值與肺功能各參數(shù)值均無相關(guān)性。3.SO_2、NO_2、O_3刺激性氣體污染物單因素的混合效應(yīng)模型固定效應(yīng)估計(jì)結(jié)果示:O_3與PEF(z=-2.16,P=0.030)的變異呈負(fù)相關(guān)。4.PM2.5和O_3聯(lián)合的多因素的混合效應(yīng)分析顯示:,PM2.5(z=-2.54,P=0.011)和O_3(z=-2.37,P=0.018)均顯示與PEF變異的方差有顯著差異,呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)兩者交互效應(yīng)分析中,PM2.5仍顯示與FEV1(z=-2.17,P=0.030)、FEV1%(z=-2.30,P=0.028)的變異的呈負(fù)相關(guān),再次證實(shí)PM2.5可對(duì)FEV1及FEV1%的變化具有一定的負(fù)向影響。小結(jié):42名哮喘患者不同時(shí)間段內(nèi),連續(xù)為期10天的短期觀察中:1.PM2.5與哮喘患者的PEF、FEV1、FEV1%、FVC負(fù)相關(guān),對(duì)于反應(yīng)小氣道功能的MEF25、MEF50、MEF75值沒有顯著影響。進(jìn)行PM2.5滯后1天效應(yīng)統(tǒng)計(jì)無顯著相關(guān)性。2.O_3每日最大8小時(shí)對(duì)PEF值呈負(fù)相關(guān),SO_2、NO_2未發(fā)現(xiàn)對(duì)肺功能有顯著效應(yīng)。3.PM2.5和O_3聯(lián)合分析,兩者均與PEF呈負(fù)相關(guān),PM2.5仍對(duì)FEV1、FEV1%呈負(fù)相關(guān)。第二部分細(xì)顆粒物加重哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性的作用及其機(jī)制研究目的:本研究的目的是觀察連續(xù)8周高濃度的PM 2.5吸入對(duì)于已經(jīng)采用OVA致敏的哮喘小鼠的病理和氣道高反應(yīng)性的影響,同時(shí)觀察細(xì)胞凋亡和TIM-1在這個(gè)過程中的作用。方法:1.試驗(yàn)動(dòng)物分組及暴露方案:40只BALB/c小鼠被分為4組:對(duì)照組,OVA組,OVA/PM組,PM組(n=10)。所有小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠(individually ventilated cages,IVCs)。對(duì)照組每日在固定器內(nèi)固定4小時(shí),每周5天,連續(xù)8周。OVA組采用OVA致敏和激發(fā),OVA/PM組采用OVA組同樣的方法致敏和激發(fā),同時(shí),將小鼠固定在PM 2.5多功能氣溶膠濃縮富集系統(tǒng)的口鼻暴露器上,每日4小時(shí),每周5天,連續(xù)8周,吸入濃縮的PM 2.5,此項(xiàng)操作在河北省石家莊市河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院霧霾實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。PM組僅僅給予吸入濃縮的PM 2.5。2.檢測指標(biāo)及方法:在試驗(yàn)過程中采用聚丙烯膜和石英膜分別收集與小鼠一致的暴露管道內(nèi)的顆粒物,并分析其成分。PM2.5暴露8周后,進(jìn)行AHR檢測,收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用酶聯(lián)免疫法檢測BALF中的白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4),白細(xì)胞介素5(interleukin-5,IL-5)和白細(xì)胞介素33(interleukin-33,IL-33)的濃度。通過光學(xué)顯微鏡檢查肺組織學(xué)結(jié)構(gòu),并通過電子顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling,TUNEL)法檢測肺組織中凋亡細(xì)胞的表達(dá)。利用免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中的Bcl-2、Bax和TIM-1表達(dá)。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,采用SPSS 19.0版軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進(jìn)行分析。采用單因素方差分析(One-Way analysis of variance,One-Way ANOVA)評(píng)價(jià)不同組之間的差異。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.顆粒物濃度及成分分析:BALB/c小鼠在連續(xù)8周暴露期間,日均暴露濃度為703μg/m~3,暴露顆粒成分分析顯示質(zhì)量濃度占據(jù)前五位的分別是NO_3~-、有機(jī)碳(Organic carbon,OC)、SO_4~(2-)、NH_4~+和元素碳(elemental carbon,EC)。2.肺組織病理及電鏡下顯微結(jié)構(gòu)觀察:OVA/PM組氣管上皮細(xì)胞輕度缺失,肺泡間隔較寬,炎性細(xì)胞浸潤,小支氣管平滑肌增生。PM組顯示細(xì)支氣管周圍的炎性細(xì)胞浸潤和肺泡上皮增生。電鏡下觀察OVA/PM組和PM組線粒體異常,核膜與線粒體嵴輕度融合退化。3.呼吸力學(xué)和AHR:OVA/PM組小鼠氣道反應(yīng)性相對(duì)于OVA組和PM組明顯升高(P0.05),而僅暴露PM 2.5組小鼠AHR相對(duì)于對(duì)照組也有明顯升高(P0.05)。4.BALF中的細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及細(xì)胞因子測定:OVA/PM組(28±6.08 vs12.33±4.51,t=4.631,P=0.002)和PM組(29.00±3.00 vs 12.33±4.51,t=4.927,P=0.001)的BALF中淋巴細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組顯著增高.OVA/PM組(6.67±1.53 vs 3.33±1.53,t=2.886,P=0.020)和PM組(6.67±1.53 vs3.33±1.53,t=2.886,P=0.020)的BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)量較OVA組比較顯著升高。IL-4(77.44±11.19 vs 48.02±10.02 pg/ml,t=4.595,P=0.002)和IL-5(15.65±1.19 vs 12.35±0.95 pg/ml,t=3.806,P=0.005)的濃度在OVA/PM組較OVA組比較顯著增加。IL-4(77.44±11.19 vs 41.47±3.40pg/ml,t=5.617,P=0.001)和IL-5(15.65±1.19 vs 10.99±1.40 pg/ml,t=5.374,P=0.001)的濃度在OVA/PM組較PM組比較顯著增加。IL-4(41.47±3.40 vs 25.46±2.98 pg/ml,t=2.501,P=0.037)濃度在PM組較對(duì)照組比較顯著增加。5.凋亡細(xì)胞表達(dá):TUNEL檢測顯示OVA/PM組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著高于OVA組(Tunel immunohistochemical scores[IHS%],1.20±0.18 vs 0.51±0.03,t=8.094,P0.001)和PM組(Tunel IHS%,1.2±0.18 vs 0.51±0.09,t=8.094,P0.001),PM組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著高于對(duì)照組(Tunel IHS%,0.51±0.09 vs 0.26±0.03,t=2.894,P=0.020)。6.Bax/Bcl-2和TIM-1表達(dá):Bax/Bcl-2比(1.51±0.18 vs 0.48±0.10,t=9.654,P0.001)和TIM-1/β-actin比(0.78±0.11 vs 0.40±0.06,t=6.818,P0.001)在OVA/PM組較OVA組比較顯著增加。Bax/Bcl-2比(1.51±0.18 vs 0.97±0.16,t=5.000,P=0.001)和TIM-1/β-actin比(0.78±0.11 vs 0.31±0.06,t=8.545,P0.001)在OVA/PM組較PM組比較顯著增加。Bax/Bcl-2比(0.97±0.16 vs 0.18±0.03,t=7.439,P0.001)和TIM-1/β-actin比(0.31±0.06 vs 0.02±0.01,t=5.109,P=0.001)在PM組較對(duì)照組比較顯著增加。小結(jié):PM 2.5可導(dǎo)致OVA敏化的哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性加劇,肺部炎癥病理加重,這一過程與凋亡及TIM-1激活可能有關(guān)。本研究將為PM2.5致哮喘的預(yù)防和治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。結(jié)論:從臨床上,可觀察到PM2.5升高可導(dǎo)致哮喘患者的PEF、FEV1、FEV1%、FVC降低,PM2.5對(duì)滯后1天的肺功能無顯著影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,采用高濃度PM 2.5吸入暴露8周可導(dǎo)致OVA敏化的哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性加劇,肺部炎癥病理加重,這一過程與凋亡及TIM-1激活可能有關(guān)。
【圖文】：

圖 1 小鼠 PM2.5 口鼻暴露系統(tǒng) nose-only PM2.5 inhalation system(HRH-MNE3Technology Co. Ltd, Beijing).器 Haier，中國箱 Haier，中國箱 Thermo Scientific液器 Eppendorf，，美國心機(jī) Thermo Scientific速離心機(jī) Thermo Scientific Bio-Tek，美國微鏡 ZEISS，德國埋機(jī) 孝感泰康達(dá)醫(yī)療設(shè)

在小鼠暴露期間，平均每日環(huán)境 PM2.5 濃度是 94μg / m3（從石環(huán)保局獲得）。除去未暴露時(shí)間和周末（實(shí)際暴露天數(shù)是 38 天）平均每日環(huán)境 PM2.5 濃度是 101μg / m3。根據(jù) PM2.5 多功能氣溶膠集系統(tǒng)實(shí)時(shí)顯示數(shù)據(jù)（每 5 分鐘自動(dòng)儲(chǔ)存實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)），計(jì)算暴露時(shí)M2.5濃度（圖 2），日最高暴露濃度 3016μg / m3，最低暴露濃度是 1m3，平均每日暴露濃度為 703μg / m3。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650688