【摘要】：目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者可以出現(xiàn)血液生成異常,但目前其機理尚不清楚。造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)的分化和自我更新等受骨髓造血微環(huán)境調(diào)節(jié)。而骨髓造血微環(huán)境中一些細胞成分,可以通過其表面粘附分子如N-cadherin等與HSCs的相互作用,從而參與調(diào)節(jié)血液生成。SLE患者體內(nèi)常有多種炎癥因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等異常增高,而這些異常水平的炎癥因子除了作用于HSCs外,還可以影響骨髓微環(huán)境中的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)、成骨細胞(osteoblast,OB)等細胞成分,通過對這些造血調(diào)節(jié)細胞來間接干擾正常的血液生成。本研究擬在體外模擬炎癥因子TNF-α作用于小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1和BMMSCs,探索其對這兩種細胞N-cadherin表達水平的影響及可能機制;并初步探索經(jīng)TNF-α預處理的MC3T3-E1細胞,對純化的小鼠Sca-1細胞體外擴增的支持作用。期望通過上述研究,初步揭示SLE患者血液生成障礙發(fā)生的可能機制。方法1、首先,用不同濃度(10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml)的TNF-α處理MC3T3-E1細胞3天,Western blot法檢測其表面粘附分子N-cadherin的表達,篩選出合適的TNF-α濃度以進行后續(xù)實驗。然后,用選定濃度的TNF-α分別處理小鼠MC3T3-E1細胞和BMMSCs不同時間,并在TNF-α處理MC3T3-E1細胞3天后,換成不含TNF-α的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)不同時間,采用Western blot法檢測N-cadherin、p-Erk1/2及p-Akt的表達。2、用CCK8法檢測經(jīng)不同濃度(0~80μM)的Erk抑制劑FR180204處理MC3T3-E1細胞不同時間(1天、2天、3天)后細胞的增殖抑制情況,篩選出合適的抑制劑濃度。用選定濃度的抑制劑處理MC3T3-E1細胞,采用Western blot法檢測N-cadherin和p-Erk1/2的表達。3、分離小鼠股骨和脛骨并收集骨髓,磁珠陽性分選富集小鼠Sca-1~+的骨髓細胞,用流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測所分離Sca-1細胞的陽性比例。4、先用造血干細胞體外擴增專用培養(yǎng)液Stemspan SFEM體外培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,分別觀察和檢測不同時間點的細胞形態(tài)和N-cadherin表達情況,并與在含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液條件下生長的MC3T3-E1細胞的結果進行比較。然后,用含TNF-α的Stemspan SFEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,3天后更換成不含TNF-α的Stemspan SFEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)不同時間點,Western blot法檢測細胞N-cadherin的表達。5、將TNF-α預處理的MC3T3-E1細胞作為飼養(yǎng)層,在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand條件下,體外擴增小鼠Sca-1~+骨髓細胞一周,隨后進行集落形成單位(colony-forming units,CFU)檢測。結果1、MC3T3-E1細胞經(jīng)TNF-α處理后,其細胞表面N-cadherin的表達水平下降,并且在一定的濃度范圍內(nèi)隨TNF-α濃度的提高而更加顯著。根據(jù)實驗結果,選擇20 ng/ml的濃度應用于后續(xù)實驗。2、20 ng/ml濃度的TNF-α處理MC3T3-E1細胞后,N-cadherin的表達水平在短時間內(nèi)無明顯變化,在培養(yǎng)1天和2天后明顯下調(diào);而在去除TNF-α后繼續(xù)體外培養(yǎng)7天后,MC3T3-E1細胞的N-cadherin表達上升至高于基礎水平。在20ng/ml濃度的TNF-α作用下,MC3T3-E1細胞的p-Erk1/2表達水平在1天內(nèi)均保持高于基礎水平;在去除TNF-α作用后,與N-cadherin相反,p-Erk1/2表達在繼續(xù)培養(yǎng)7天后下降至低于基礎水平。3、TNF-α處理小鼠BMMSCs后,短時間(30min和3h)內(nèi),N-cadherin和p-Erk1/2的表達水平升高;處理3天后,N-cadherin、p-Erk1/2的表達均逐漸降至基礎水平之下。在去除TNF-α后繼續(xù)培養(yǎng)的過程中,BMMSCs的N-cadherin表達可上升至高于基礎水平,p-Erk1/2的表達則繼續(xù)下降。與p-Erk1/2不同,BMMSCs的p-Akt表達水平在TNF-α處理的整個過程中均無明顯變化。4、根據(jù)Erk抑制劑FR180204對MC3T3-E1細胞的增殖抑制作用情況,選定7.5μM和10μM兩個濃度進行后續(xù)實驗。與對照組相比,經(jīng)7.5μM和10μM兩種濃度Erk抑制劑處理1天后,MC3T3-E1細胞的p-Erk1/2表達水平均受到明顯抑制。在用抑制劑處理的整個過程中,N-cadherin的表達水平均明顯高于對照組。5、小鼠骨髓細胞經(jīng)Sca-1抗體的免疫磁珠陽性分選富集后,流式細胞術檢測Sca-1陽性細胞的比例均在90%以上。6、MC3T3-E1細胞用Stemspan SFEM培養(yǎng)液培養(yǎng)后,細胞形態(tài)與在含有10%FBS的α-MEM條件下培養(yǎng)的細胞無明顯區(qū)別,并且N-cadherin的表達水平也無明顯差異。不同濃度(10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml)的TNF-α處理3天后,N-cadherin表達明顯低于基礎水平。用20 ng/ml濃度的TNF-α處理3后,在去除TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)的一周內(nèi),細胞的N-cadherin表達均保持在高于基礎水平。換用Stemspan SFEM培養(yǎng)液后,TNF-α對MC3T3-E1細胞N-cadherin表達的影響類似于其在含有10%FBSα-MEM條件下培養(yǎng)的結果。7、以TNF-α預處理的MC3T3-E1細胞作為飼養(yǎng)層,在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand條件下,體外擴增小鼠純化的Sca-1~+骨髓細胞后,其總CFU數(shù)目低于對照組,CFU-pre-B數(shù)目較對照組明顯升高,BFU-E及CFU-GM數(shù)目較對照組顯著降低。結論炎癥因子TNF-α在作用于小鼠前成骨細胞MC3T3-E1和BMMSCs后,可影響細胞的N-cadherin表達水平和Erk1/2的磷酸化。TNF-α對N-cadherin表達水平的影響可能與Erk1/2通路有關。經(jīng)TNF-α預處理后N-cadherin高表達的MC3T3-E1細胞在與小鼠Sca-1~+骨髓造血細胞相互作用過程中,對骨髓造血細胞的分化和增殖均可以產(chǎn)生影響。我們的研究提示,SLE骨髓微環(huán)境中造血支持相關細胞粘附分子N-cadherin的異常,可能是骨髓血液生成異常的機制之一。
【圖文】：

第三章 實驗結果3.1 TNF-α濃度的篩選用含有 10 % FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液配制終濃度分別為 10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml 的 TNF-α溶液，處理準備好的 MC3T3-E1 細胞，細胞密度為 2.5×104個/ ml。每天更換新的含有相應終濃度 TNF-α的培養(yǎng)液，培養(yǎng) 3 天后，收集細胞，Western blot 法檢測粘附分子 N-cadherin 表達水平的變化。實驗結果顯示，MC3T3-E1 細胞能夠表達粘附分子 N-cadherin。與對照組相比，MC3T3-E1 細胞分別經(jīng)終濃度為 10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml 的 TNF-α處理 3 天后，其粘附分子 N-cadherin 的表達水平均下降，并且在一定濃度范圍內(nèi)隨著 TNF-α濃度的增加而更加明顯（圖 3.1，F(xiàn)=115.0，P<0.05，n=3）。

炎癥因子 TNF-α可影響小鼠 MC3T3-E1 細胞系的 N-cadherin 表達及其體外造血支持能力3.2 實驗細胞經(jīng) TNF-α處理后 N-cadherin、p-Erk1/2 以及 p-Akt 的表達3.2.1 MC3T3-E1 經(jīng) TNF-α處理后其粘附分子 N-cadherin 的表達為了了解 TNF-α對 N-cadherin 表達的下調(diào)作用在去除 TNF-α后是否依然存在，我們用終濃度為 20 ng/ml 的 TNF-α處理 MC3T3-E1 細胞。在用 TNF-α連續(xù)處理 3 天后，將含有 TNF-α的培養(yǎng)液去除，換成含有 10 % FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 1 ~ 4 天。Western blot 結果表明，，與上述實驗結果一致，MC3T3-E1 細胞經(jīng) TNF-α處理 3 天后，其 N-cadherin 的表達水平較對照組明顯下降。然而，在去除 TNF-α后繼續(xù)培養(yǎng)的過程中，從去除后 2 天開始，隨著培養(yǎng)時間的延長，N-cadherin 的表達逐漸恢復至高于基礎水平（圖 3.2，F(xiàn)=620.1，P<0.01，n=3）。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R593.241

【參考文獻】

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本文編號：2648169