【摘要】：目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者可以出現(xiàn)血液生成異常,但目前其機(jī)理尚不清楚。造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)的分化和自我更新等受骨髓造血微環(huán)境調(diào)節(jié)。而骨髓造血微環(huán)境中一些細(xì)胞成分,可以通過其表面粘附分子如N-cadherin等與HSCs的相互作用,從而參與調(diào)節(jié)血液生成。SLE患者體內(nèi)常有多種炎癥因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等異常增高,而這些異常水平的炎癥因子除了作用于HSCs外,還可以影響骨髓微環(huán)境中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)、成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)等細(xì)胞成分,通過對(duì)這些造血調(diào)節(jié)細(xì)胞來(lái)間接干擾正常的血液生成。本研究擬在體外模擬炎癥因子TNF-α作用于小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1和BMMSCs,探索其對(duì)這兩種細(xì)胞N-cadherin表達(dá)水平的影響及可能機(jī)制;并初步探索經(jīng)TNF-α預(yù)處理的MC3T3-E1細(xì)胞,對(duì)純化的小鼠Sca-1細(xì)胞體外擴(kuò)增的支持作用。期望通過上述研究,初步揭示SLE患者血液生成障礙發(fā)生的可能機(jī)制。方法1、首先,用不同濃度(10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml)的TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞3天,Western blot法檢測(cè)其表面粘附分子N-cadherin的表達(dá),篩選出合適的TNF-α濃度以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后,用選定濃度的TNF-α分別處理小鼠MC3T3-E1細(xì)胞和BMMSCs不同時(shí)間,并在TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞3天后,換成不含TNF-α的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間,采用Western blot法檢測(cè)N-cadherin、p-Erk1/2及p-Akt的表達(dá)。2、用CCK8法檢測(cè)經(jīng)不同濃度(0~80μM)的Erk抑制劑FR180204處理MC3T3-E1細(xì)胞不同時(shí)間(1天、2天、3天)后細(xì)胞的增殖抑制情況,篩選出合適的抑制劑濃度。用選定濃度的抑制劑處理MC3T3-E1細(xì)胞,采用Western blot法檢測(cè)N-cadherin和p-Erk1/2的表達(dá)。3、分離小鼠股骨和脛骨并收集骨髓,磁珠陽(yáng)性分選富集小鼠Sca-1~+的骨髓細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)所分離Sca-1細(xì)胞的陽(yáng)性比例。4、先用造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增專用培養(yǎng)液Stemspan SFEM體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,分別觀察和檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)和N-cadherin表達(dá)情況,并與在含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液條件下生長(zhǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行比較。然后,用含TNF-α的Stemspan SFEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,3天后更換成不含TNF-α的Stemspan SFEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn),Western blot法檢測(cè)細(xì)胞N-cadherin的表達(dá)。5、將TNF-α預(yù)處理的MC3T3-E1細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand條件下,體外擴(kuò)增小鼠Sca-1~+骨髓細(xì)胞一周,隨后進(jìn)行集落形成單位(colony-forming units,CFU)檢測(cè)。結(jié)果1、MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)TNF-α處理后,其細(xì)胞表面N-cadherin的表達(dá)水平下降,并且在一定的濃度范圍內(nèi)隨TNF-α濃度的提高而更加顯著。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇20 ng/ml的濃度應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、20 ng/ml濃度的TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞后,N-cadherin的表達(dá)水平在短時(shí)間內(nèi)無(wú)明顯變化,在培養(yǎng)1天和2天后明顯下調(diào);而在去除TNF-α后繼續(xù)體外培養(yǎng)7天后,MC3T3-E1細(xì)胞的N-cadherin表達(dá)上升至高于基礎(chǔ)水平。在20ng/ml濃度的TNF-α作用下,MC3T3-E1細(xì)胞的p-Erk1/2表達(dá)水平在1天內(nèi)均保持高于基礎(chǔ)水平;在去除TNF-α作用后,與N-cadherin相反,p-Erk1/2表達(dá)在繼續(xù)培養(yǎng)7天后下降至低于基礎(chǔ)水平。3、TNF-α處理小鼠BMMSCs后,短時(shí)間(30min和3h)內(nèi),N-cadherin和p-Erk1/2的表達(dá)水平升高;處理3天后,N-cadherin、p-Erk1/2的表達(dá)均逐漸降至基礎(chǔ)水平之下。在去除TNF-α后繼續(xù)培養(yǎng)的過程中,BMMSCs的N-cadherin表達(dá)可上升至高于基礎(chǔ)水平,p-Erk1/2的表達(dá)則繼續(xù)下降。與p-Erk1/2不同,BMMSCs的p-Akt表達(dá)水平在TNF-α處理的整個(gè)過程中均無(wú)明顯變化。4、根據(jù)Erk抑制劑FR180204對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖抑制作用情況,選定7.5μM和10μM兩個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比,經(jīng)7.5μM和10μM兩種濃度Erk抑制劑處理1天后,MC3T3-E1細(xì)胞的p-Erk1/2表達(dá)水平均受到明顯抑制。在用抑制劑處理的整個(gè)過程中,N-cadherin的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組。5、小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)Sca-1抗體的免疫磁珠陽(yáng)性分選富集后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Sca-1陽(yáng)性細(xì)胞的比例均在90%以上。6、MC3T3-E1細(xì)胞用Stemspan SFEM培養(yǎng)液培養(yǎng)后,細(xì)胞形態(tài)與在含有10%FBS的α-MEM條件下培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)明顯區(qū)別,并且N-cadherin的表達(dá)水平也無(wú)明顯差異。不同濃度(10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml)的TNF-α處理3天后,N-cadherin表達(dá)明顯低于基礎(chǔ)水平。用20 ng/ml濃度的TNF-α處理3后,在去除TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)的一周內(nèi),細(xì)胞的N-cadherin表達(dá)均保持在高于基礎(chǔ)水平。換用Stemspan SFEM培養(yǎng)液后,TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞N-cadherin表達(dá)的影響類似于其在含有10%FBSα-MEM條件下培養(yǎng)的結(jié)果。7、以TNF-α預(yù)處理的MC3T3-E1細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,在造血支持因子SCF、TPO及Flt3-Ligand條件下,體外擴(kuò)增小鼠純化的Sca-1~+骨髓細(xì)胞后,其總CFU數(shù)目低于對(duì)照組,CFU-pre-B數(shù)目較對(duì)照組明顯升高,BFU-E及CFU-GM數(shù)目較對(duì)照組顯著降低。結(jié)論炎癥因子TNF-α在作用于小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1和BMMSCs后,可影響細(xì)胞的N-cadherin表達(dá)水平和Erk1/2的磷酸化。TNF-α對(duì)N-cadherin表達(dá)水平的影響可能與Erk1/2通路有關(guān)。經(jīng)TNF-α預(yù)處理后N-cadherin高表達(dá)的MC3T3-E1細(xì)胞在與小鼠Sca-1~+骨髓造血細(xì)胞相互作用過程中,對(duì)骨髓造血細(xì)胞的分化和增殖均可以產(chǎn)生影響。我們的研究提示,SLE骨髓微環(huán)境中造血支持相關(guān)細(xì)胞粘附分子N-cadherin的異常,可能是骨髓血液生成異常的機(jī)制之一。
【圖文】：

第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 TNF-α濃度的篩選用含有 10 % FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液配制終濃度分別為 10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml 的 TNF-α溶液，處理準(zhǔn)備好的 MC3T3-E1 細(xì)胞，細(xì)胞密度為 2.5×104個(gè)/ ml。每天更換新的含有相應(yīng)終濃度 TNF-α的培養(yǎng)液，培養(yǎng) 3 天后，收集細(xì)胞，Western blot 法檢測(cè)粘附分子 N-cadherin 表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MC3T3-E1 細(xì)胞能夠表達(dá)粘附分子 N-cadherin。與對(duì)照組相比，MC3T3-E1 細(xì)胞分別經(jīng)終濃度為 10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml 的 TNF-α處理 3 天后，其粘附分子 N-cadherin 的表達(dá)水平均下降，并且在一定濃度范圍內(nèi)隨著 TNF-α濃度的增加而更加明顯（圖 3.1，F(xiàn)=115.0，P<0.05，n=3）。

炎癥因子 TNF-α可影響小鼠 MC3T3-E1 細(xì)胞系的 N-cadherin 表達(dá)及其體外造血支持能力3.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng) TNF-α處理后 N-cadherin、p-Erk1/2 以及 p-Akt 的表達(dá)3.2.1 MC3T3-E1 經(jīng) TNF-α處理后其粘附分子 N-cadherin 的表達(dá)為了了解 TNF-α對(duì) N-cadherin 表達(dá)的下調(diào)作用在去除 TNF-α后是否依然存在，我們用終濃度為 20 ng/ml 的 TNF-α處理 MC3T3-E1 細(xì)胞。在用 TNF-α連續(xù)處理 3 天后，將含有 TNF-α的培養(yǎng)液去除，換成含有 10 % FBS 的α-MEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 1 ~ 4 天。Western blot 結(jié)果表明，，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，MC3T3-E1 細(xì)胞經(jīng) TNF-α處理 3 天后，其 N-cadherin 的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降。然而，在去除 TNF-α后繼續(xù)培養(yǎng)的過程中，從去除后 2 天開始，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，N-cadherin 的表達(dá)逐漸恢復(fù)至高于基礎(chǔ)水平（圖 3.2，F(xiàn)=620.1，P<0.01，n=3）。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R593.241

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2648169