【摘要】：目的:高尿酸血癥(HUA)與多種疾病相關(guān),如痛風(fēng),糖尿病。相關(guān)研究表明2型糖尿病(T2DM)患者的HUA發(fā)生率分別為24.1%和33.8%。并且,HUA已被證明是腎臟疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,它可引起腎臟炎癥,誘發(fā)氧化應(yīng)激并引起腎小管損傷。因此,急需開發(fā)一種新型藥劑來同時(shí)改善高血糖和高尿酸血癥。恩格列凈(Empagliflozin),一種新型的鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SGLT2)抑制劑,通過阻斷腎近曲小管表面SGLT2受體,抑制葡萄糖的重吸收,促進(jìn)尿液中葡萄糖的排泄,從而發(fā)揮降糖的作用。諸多文獻(xiàn)報(bào)道,Empagliflozin除降糖作用外,還有降低血尿酸(SUA),降低心血管死亡率及降低血壓等作用。而Empagliflozin降低血尿酸的具體分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中,我們提出了一種可能的機(jī)制來解釋Empagliflozin如何減輕高尿酸血癥,并為高尿酸血癥的治療提供有見地的指導(dǎo)。方法:1、動(dòng)物水平:選取6周齡的雄性KK-Ay小鼠(一種自發(fā)型T2DM模型小鼠)作為研究對(duì)象,給予KK-Ay小鼠專用飼料,適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后將它們隨機(jī)分為3組:糖尿病空白對(duì)照組(KK-Ay組,n=10),糖尿病伴高尿酸血癥模型組(KK-Ay+HUA組,n=10),Empagliflozin治療組(KK-Ay+HUA+EMP組,n=10)。氧嗪酸鉀(PO)和次黃嘌呤(HX)腹腔注射誘導(dǎo)高尿酸血癥,Empagliflozin灌胃治療。8周后經(jīng)代謝籠留取小鼠24h尿標(biāo)本,經(jīng)摘眼球取血法留取空腹血標(biāo)本,腎臟、回腸組織取材。HE,PAS法觀察腎臟和回腸組織形態(tài)變化。RT-PCR、WB法檢測(cè)UA轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2、OAT1、OAT3、GLUT9和URAT1在腎臟和回腸中的相對(duì)表達(dá)。WB法進(jìn)一步驗(yàn)證p-AMPK、p-Akt和p-CREB通路蛋白在兩種組織中的相對(duì)表達(dá)。2、細(xì)胞水平:用含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)。將細(xì)胞分為四組:(1)高糖對(duì)照組,即HG組(30mmol/L);(2)高糖伴高尿酸(10mg/dl)模型組,即HG+HUA組;(3)高糖伴高尿酸模型下恩格列凈(50umol/L)治療組,即HG+HUA+EMP組;(4)AMPK抑制劑(Dorsomorphin)組(10umol/L),即HG+HUA+EMP+Dorsomorphin組。WB法檢測(cè)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2和p-AMPK、p-Akt和p-CREB通路蛋白表達(dá)。PCR或WB法檢測(cè)ABCG2啟動(dòng)子質(zhì)粒和CREB過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。Lipo2000瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染以下七組質(zhì)粒:(1)ABCG2啟動(dòng)子質(zhì)粒和CREB過表達(dá)質(zhì)粒(ABCG2+CREB);(2)ABCG2啟動(dòng)子質(zhì)粒和CREB空載質(zhì)粒(ABCG2+CREBNC);(3)ABCG2空載質(zhì)粒和CREB質(zhì)粒(ABCG2NC+CREB);(4)ABCG2空載質(zhì)粒和CREB空載質(zhì)粒(ABCG2NC+CREBNC);(5)ABCG2啟動(dòng)子511到518位點(diǎn)單突變質(zhì)粒和CREB質(zhì)粒(ABCG2mut511+CREB);(6)ABCG2啟動(dòng)子833到840位點(diǎn)單突變質(zhì)粒和CREB質(zhì)粒(ABCG2mut833+CREB);(7)ABCG2啟動(dòng)子511到518位點(diǎn)和833到840位點(diǎn)雙突變位點(diǎn)質(zhì)粒和CREB質(zhì)粒(ABCG2 double mut511/833+CREB)。采取Ch IP實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CREB與ABCG2啟動(dòng)子質(zhì)粒結(jié)合情況。結(jié)果:1、與糖尿病空白組(KK-Ay)和糖尿病伴高尿酸血癥組(KK-Ay+HUA)相比Empagliflozin治療組(KK-Ay+HUA+EMP)可顯著降低血糖、血尿酸水平,但是卻增加尿糖、尿尿酸排泄和尿酸排泄率(FEUA)(P0.05)。腎臟HE和PAS染色顯示,與KK-Ay組小鼠相比,KK-Ay+HUA組小鼠顯示出較明顯的腎小管擴(kuò)張,水腫變性和腎小球系膜沉積,而這些特征在KK-Ay+HUA+EMP組中顯著減弱;回腸的HE和PAS染色顯示,KK-Ay+HUA組呈現(xiàn)出不規(guī)則絨毛、倒伏和炎性細(xì)胞浸潤顯著增加的現(xiàn)象,而這種現(xiàn)象在KK-Ay+HUA+EMP組中部分改善。2、q RT-PCR結(jié)果顯示,在Empagliflozin治療下,腎臟中跟尿酸排泄功能相關(guān)的受體ABCG2、OAT1、OAT3表達(dá)上調(diào)(P0.05),而跟尿酸重吸收功能相關(guān)的受體URAT1表達(dá)下降(P0.05)。同樣地,在回腸組織中也呈現(xiàn)出跟尿酸排泄相關(guān)受體ABCG2表達(dá)上調(diào)(P0.05),而跟尿酸重吸收相關(guān)受體GLUT9無明顯變化。WB顯示恩格列凈可以使尿酸排泄相關(guān)受體ABCG2表達(dá)上調(diào)(P0.05),而其它受體均無明顯變化。3、WB結(jié)果表明在腎臟和回腸組織中KK-Ay+HUA+EMP治療組均呈現(xiàn)出p-AMPK/p-Akt/p-CREB信號(hào)通路蛋白表達(dá)增加(P0.05),而KK-Ay與KK-Ay+HUA組間無明顯差異。4、人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中也觀察到相同的表現(xiàn)(P0.05),給予AMPK抑制劑(Dorsomorphin)后,ABCG2受體和p-AMPK/p-Akt/p-CREB信號(hào)通路蛋白均呈現(xiàn)明顯下調(diào)(P0.05)。免疫熒光結(jié)果與WB結(jié)果一致。5、在HK-2細(xì)胞中使用Ch IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CREB可以與ABCG2啟動(dòng)子結(jié)合;在HEK-293A細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)ABCG2,再次用Ch IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組相比,ABCG2過表達(dá)組呈現(xiàn)出CREB與ABCG2啟動(dòng)子區(qū)更多的結(jié)合(P0.05)。6、使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證CREB可以與ABCG2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合(P0.05)。根據(jù)JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的CREB與ABCG2啟動(dòng)子區(qū)的可能結(jié)合位點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成了ABCG2啟動(dòng)子511-518、833-840區(qū)段位點(diǎn)的單突變和雙突變質(zhì)粒,分別和CREB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染與HEK-293A細(xì)胞中,再次使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CREB與ABCG2突變序列結(jié)合程度降低(P0.05)。結(jié)論:1、恩格列凈降低血尿酸水平,增加尿尿酸排泄。2、恩格列凈改善腎臟和回腸的組織病理學(xué)變化。3、恩格列凈促進(jìn)腎臟和回腸中ABCG2的表達(dá)。4、恩格列凈在腎臟和回腸中通過調(diào)控AMPK/Akt/CREB信號(hào)通路改善血尿酸水平。5、恩格列凈在人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中通過調(diào)控AMPK/Akt/CREB信號(hào)通路改善血尿酸水平。6、染色質(zhì)免疫沉淀(Ch IP)測(cè)定以證明CREB與ABCG2啟動(dòng)子結(jié)合。7、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明CREB與ABCG2啟動(dòng)子結(jié)合。8、恩格列凈通過AMPK/Akt/CREB信號(hào)通路上調(diào)ABCG2的表達(dá),進(jìn)而降低2型糖尿病合并高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平。
【圖文】：

SGLT2抑制劑作用機(jī)制圖

2 次。使用中性樹膠加蓋蓋玻片封片，晾干后置于顯微鏡下拍片成像。1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM）。進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)以確定三組以上的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并使用 Tukey 的事后檢驗(yàn)來比較它們中的任何兩組。P<0.05 被認(rèn)為是有顯著差異。1.2 結(jié)果1.2.1 各組小鼠一般情況比較（1）KK-Ay 小鼠是自發(fā)型 2 型糖尿病模型小鼠，這類小鼠從 10 周齡開始，血糖持續(xù)升高，體重持續(xù)增加，肥胖表征凸顯。分別按照上述方法對(duì)三組小鼠進(jìn)行干預(yù)，8 周后檢測(cè)三組小鼠的基本情況。三組小鼠均呈現(xiàn)懶惰，不愛運(yùn)動(dòng)，多飲多尿等狀態(tài)。其中三組小鼠之間的體重沒有明顯差異，平均體重 35g。本實(shí)驗(yàn)還觀察到 KK-Ay 組和 KK-Ay + HUA 組小鼠之間的血糖或尿糖水平?jīng)]有明顯差異，而恩格列凈治療組則呈現(xiàn)出明顯地血糖降低（P<0.05）和尿糖排出增加的現(xiàn)象（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.1;R589.7

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5 紀(jì)w耷，

本文編號(hào)：2646667