【摘要】：顱骨由顱蓋骨、顱面骨和顱底組成。它們是通過不同的發(fā)育模式形成的。顱蓋骨是通過膜內(nèi)成骨形成的,在膜內(nèi)成骨過程中,位于顱縫的間充質(zhì)前體細胞直接分化為成骨細胞,成骨細胞分泌骨基質(zhì)成骨,成骨細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌毎?顱骨得以生長。顱底骨是通過軟骨內(nèi)成骨形成的,顱底軟骨連接的骨化使得顱底生長和擴張。Apert綜合征(AS)是以顱縫早閉(Craniosynostosis)為特征的一種遺傳綜合征。其表現(xiàn)的主要特征是顱縫早閉,顱底異常,面部中部發(fā)育不全,手足并指(趾)等。另外,AS患者顱內(nèi)壓升高,智力低下。AS主要由成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)的相鄰氨基酸Ser252Trp(S252W)或Pro253Arg(P253R)的兩種突變引起。對Apert患者和小鼠模型的研究表明,其顱縫、顱底和大腦均出現(xiàn)發(fā)育異常,它們可能參與了Apert綜合征顱骨畸形形成。在AS患者、模擬AS的小鼠模型中最常見的就是冠狀縫過早閉合,目前的大多數(shù)人認為顱縫早閉是導(dǎo)致顱骨畸形的主要原因。據(jù)報道,AS患者的顱底軟骨連接發(fā)育異常,包括蝶篩骨軟骨連接和蝶枕軟骨連接過早融合。全身表達或軟骨細胞特異表達FGFR2-Pro253Arg突變的小鼠也表現(xiàn)出顱底軟骨連接提前融合、顱底變短等表型。軟骨發(fā)育異�？赡茉贏S患者或小鼠模型的顱骨畸形形成中發(fā)揮重要作用。除顱骨發(fā)育不良外,AS患者還表現(xiàn)出大腦畸形和智力遲鈍等神經(jīng)系統(tǒng)異常,目前AS患者腦形態(tài)異常的原因尚不清楚。人們通常認為AS中的腦畸形是顱縫早閉的結(jié)果。然而,有研究者發(fā)現(xiàn),在AS小鼠的顱骨顱縫閉合之前,大腦發(fā)育異常已經(jīng)發(fā)生,因此他們認為大腦畸形在Apert中是原發(fā)性的,而不是繼發(fā)于顱骨異常。但是,AS大腦畸形是原發(fā)還是繼發(fā)作用造成的尚需進一步明確。迄今為止,顱骨畸形的發(fā)病機制仍不完全清楚。進一步了解顱縫、顱底及大腦在顱骨畸形形成中的作用對AS的治療策略的制定,以及新療法的研發(fā)都很重要。過去的研究通常用全身表達突變FGFR2的Apert小鼠進行的,不能清晰地解析突變FGFR2在顱蓋骨(顱縫)、大腦和顱底異常發(fā)育中的直接作用。長期以來,圍繞Apert綜合征的治療措施主要是手術(shù)矯正治療及并發(fā)癥處理等。手術(shù)矯正方法包括開放性顱骨重建,牽引和微創(chuàng)技術(shù),如局部顱骨切除術(shù),枕骨瓣松解以及顱蓋骨重塑等。手術(shù)的目標(biāo)主要是改善顱骨形態(tài),延遲顱縫閉合,緩解顱內(nèi)高壓。但是,由于進行性頭顱發(fā)育不良,僅做一次手術(shù)往往難以達到效果,往往需要分期進行數(shù)次手術(shù),容易引起其它并發(fā)癥,如腦脊液泄漏等,增加患者痛苦及家庭負擔(dān)。上述表明僅僅手術(shù)治療Apert綜合征難以達到較理想的治療效果。多年來,針對Apert的治療策略方面的研究相對較少,導(dǎo)致缺乏有效緩解Apert顱骨畸形的治療藥物。近來,分子治療展現(xiàn)出強大的應(yīng)用前景,人們越來越關(guān)注通過分子調(diào)控手段來治療顱縫早閉。比如,FGFR酪氨酸激酶抑制劑(PDF303074)被證明可部分緩解FGFR2突變導(dǎo)致的Crouzon綜合征的冠狀縫早閉癥狀。Wang等發(fā)現(xiàn)在Beare-Stevenson綜合征p38 MAPK途徑異常激活,而用p38激酶抑制劑處理后抑制了顱縫過早閉合。Apert小鼠小梁骨形成增加,進一步用Wnt/β-catenin抑制劑處理后部分緩解了這一進程。在顱縫早閉的小鼠模型中,絲裂原活化蛋白(MAP)激酶1和2(ERK1/2)抑制劑U0126在Apert小鼠中也有部分抑制顱縫早閉的作用。這些研究表明用分子治療手段來治療顱縫早閉是可行的。Apert中的FGFR2增強突變導(dǎo)致多個下游信號傳導(dǎo)失調(diào),包括ERK1/2,P38,PI-3K和PLCγ途徑等。盡管用抑制劑對單個下游信號分子或互作的信號進行抑制(例如抑制ERK1/2)可以減輕Apert異常的顱縫閉合表型,但是由于其它異常信號通路的參與,往往只能獲得部分緩解效果。此外,這些抑制劑特異性不高,往往帶來嚴重的副作用,抑制這些信號通路可能帶來潛在的風(fēng)險。靶向突變FGFR2分子的生物治療與手術(shù)治療相結(jié)合,有望通過藥物緩解癥狀,減少手術(shù)次數(shù)及并發(fā)癥風(fēng)險,減輕病人痛苦及家庭負擔(dān)。為了闡明顱蓋(顱縫)、顱底及大腦在AS顱骨形態(tài)異常發(fā)病機制中的作用,本研究通過將FGFR2+/P253R-neo小鼠與Col2a1-Cre、骨鈣素驅(qū)動的Cre(OC-Cre)小鼠和Nestin-Cre小鼠繁殖,建立軟骨細胞、成骨細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細胞(CNS)中特異表達突變型FGFR2的小鼠。然后利用歐幾里德距離矩陣分析(EDMA)技術(shù),通過顯微CT和核磁共振定量分析這些突變小鼠的顱骨和大腦形態(tài)。從治療方面考慮,我們篩選到一個小干擾RNA(SiRNA)可以特異地靶向Fgfr2-P253R等位基因,該siRNA可通過減輕Apert小鼠原代成骨細胞的異常分化和基質(zhì)礦化。另外,本研究篩選到可高效遞送治療表達于顱骨組織及細胞的9型AAV病毒。AAV9運載的Fgfr2-shRNA(AAV9-Fgfr2-shRNA)在小鼠顱骨局部表達可以緩解Apert冠狀縫提前閉合狀態(tài),也可緩解顱骨異常降低的顱骨骨量。本研究表明基于RNAi的分子治療方法,可以結(jié)合其它方法(包括手術(shù)治療)治療AS乃至其它骨骼遺傳疾病。研究方法:第一部分Apert綜合征頭顱畸形是由顱蓋骨、顱底和大腦發(fā)育異常的綜合作用導(dǎo)致的1.建立Apert小鼠,軟骨細胞特異表達FGFR2突變的Col2a1-253,成骨細胞特異表達FGFR2突變OC-253,以及中樞神經(jīng)祖細胞特異表達FGFR2突變的Nestin-253小鼠模型,測量小鼠的體重和體長等指標(biāo),利用小動物X光機照片、小動物Micro-CT觀察小鼠大體表型和骨骼表型。2.用小動物X光機、小動物Micro-CT、病理組織染色等研究各突變小鼠顱骨大體表型,顱縫閉合狀態(tài),顱底骨形態(tài)及軟骨連接融合情況。用核磁共振分析Nestin-253小鼠的大腦形態(tài)。3.定義一系列顱骨形態(tài)特異標(biāo)志點,取各突變小鼠顱骨上標(biāo)志點的三維坐標(biāo)值,用歐氏距離矩陣分析(EDMA)方法計算標(biāo)志點之間的距離值,并分析與野生對照小鼠有統(tǒng)計差異的距離,獲得突變小鼠顱骨形態(tài)發(fā)生變化的部位,比較各突變小鼠之間的顱骨形態(tài)差異。第二部分Apert綜合征頭顱畸形的分子治療探索1.根據(jù)Apert小鼠(FGFR2~(+/P253R))突變序列設(shè)計一系列與之互補的siRNA,建立Apert小鼠模型,分離其顱骨原代細胞,用siRNA處理該細胞并用定量PCR、WB等檢測突變及總Fgfr2的表達變化,評價各siRNA對突變Fgfr2的干擾效率。2.篩選得到的siRNA在顱骨細胞中進一步驗證其干擾效果,siRNA處理細胞后用定量PCR、MTT、茜素紅染色、ALP染色等檢測細胞增生、分化、礦化。用WB檢測FGF/FGFR下游信號分子表達變化。3.用siRNA對體外培養(yǎng)的Apert及WT小鼠顱蓋骨進行處理,培養(yǎng)7天后用X光、Micro-CT、病理切片等研究顱縫閉合情況,評價顱骨的質(zhì)量。4.用含熒光報告基因GFP的質(zhì)粒的病毒AAV2-GFP、AAV5-GFP、AAV-DJ-GFP、AAV9-GFP,局部注射小鼠顱骨,注射后5d和30d檢測顱骨部位熒光表達情況,篩選能較高效率感染顱骨細胞的AAV亞型。5.用篩選到的AAV亞型病毒包裝Fgfr2-shRNA,活體局部注射Apert及WT小鼠顱骨,評價小鼠顱縫閉合情況及顱骨質(zhì)量。研究結(jié)果:第一部分Apert綜合征頭顱畸形是由顱蓋骨、顱底和大腦發(fā)育異常的綜合作用導(dǎo)致1.建立了軟骨細胞特異表達FGFR2突變的Col2a1-253,成骨細胞特異表達FGFR2突變OC-253,以及中樞神經(jīng)祖細胞特異表達FGFR2突變的Nestin-253小鼠模型,Col2a1-253,OC-253以及Nestin-253小鼠的體重和體長與WT小鼠比較沒有明顯變化。用小動物X光機照片、小動物Micro-CT檢測表明突變小鼠的大體表型也無明顯變化。2.X光機、Micro-CT、病理組織染色等研究表明Col2a1-253小鼠的顱骨出現(xiàn)了Apert綜合征類似的顱骨畸形,顱骨長度縮短、左右寬度和上下高度變化不顯著,部分小鼠鼻骨扭曲,顱底軟骨連接融合提前、顱底變短。CT及HE染色表明Col2a1-253小鼠冠狀縫閉合程度增加。OC-253小鼠8周齡時面部鼻骨部位輕微縮短,顱骨其它部位變化不顯著。8周的Nestin-253小鼠的大腦后部的高度增加,顱骨后部高度也相應(yīng)增加,其它部位變化不顯著。3.用EDMA方法分析突變與野生對照小鼠顱骨形態(tài)差異,發(fā)現(xiàn)Col2a1-253小鼠的顱骨出現(xiàn)了Apert綜合征類似的顱骨畸形,顱骨前后軸長度縮短、左右寬度和上下高度滿意明顯變化,顱底軟骨連接融合提前、顱底變短。OC-253小鼠8周齡時面部鼻骨部位縮短,顱骨其它部位變化不顯著。8周的Nestin-253小鼠的大腦后部的高度增加,顱骨后部高度也增加。第二部分Apert綜合征頭顱畸形的分子治療探索1.按照Apert小鼠(FGFR2~(+/P253R))突變序列設(shè)計了11個與之互補的siRNA(S1-S11),用siRNA處理Apert小鼠顱骨原代細胞后并用定量PCR、WB等檢測發(fā)現(xiàn)S2對突變Fgfr2 mRNA的干擾效率較高,對正常Fgfr2 mRNA影響最小,篩選到S2是最好特異地靶向突變Fgfr2的siRNA。2.S2處理顱骨細胞后,定量PCR發(fā)現(xiàn)突變的Fgfr2 mRNA表達明顯降低、Apert成骨細胞分化標(biāo)記分子Collagen 1,Runx2等的表達異常得到緩解。MTT檢測發(fā)現(xiàn)細胞增生變化不顯著。定量PCR、茜素紅染色、ALP染色等檢測發(fā)現(xiàn)Apert細胞分化、礦化均有明顯降低。用WB檢測發(fā)現(xiàn)Apert細胞異常增強的p-ERK1/2、p-P38表達有效降低。3.S2處理體外培養(yǎng)的Apert及WT小鼠顱蓋骨后,發(fā)現(xiàn)X光、Micro-CT、病理切片及HE染色等發(fā)現(xiàn)Apert顱蓋骨冠狀縫閉合程度有效緩解,顱蓋骨的質(zhì)量有效改善。4.熒光檢測篩選AAV2-GFP、AAV5-GFP、AAV-DJ-GFP、AAV9-GFP病毒,發(fā)現(xiàn)AAV9能較高效率感染顱骨細胞。5.AAV9-Fgfr2-shRNA病毒活體局部注射Apert及WT小鼠顱骨,發(fā)現(xiàn)Apert顱骨成骨細胞分化標(biāo)記分子Collagen 1,Runx2等表達得到有效緩解,冠狀縫閉合程度有效緩解,顱蓋骨的質(zhì)量也得到有效改善。結(jié)論:一.軟骨特異增強FGFR2突變小鼠、成骨細胞特異增強FGFR2突變小鼠以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細胞特異增強FGFR2突變小鼠均表現(xiàn)出Apert綜合征小鼠頭顱的部分發(fā)育異常表型,表明軟骨、成骨、大腦均是Apert頭顱畸形的原發(fā)部位,Apert頭顱畸形是由顱蓋骨、顱底和大腦發(fā)育異常的綜合作用導(dǎo)致的。二.篩選到9型腺相關(guān)病毒(AAV9)能夠高效的感染顱骨組織,可作為運送外源基因在骨組織表達的載體。三.S2及Fgfr2-shRNA處理能在體外細胞、體外培養(yǎng)的顱蓋骨、活體小鼠中有效干擾突變Fgfr2的表達,并緩解細胞的分化、基質(zhì)礦化、顱縫閉合狀態(tài)以及顱骨質(zhì)量。
【圖文】：

析被用來檢測多組樣本間的差異，獨立樣本 T13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理。所有數(shù)值以均值加減計學(xué)差異。P253R 在小鼠軟骨細胞中的特異表達導(dǎo)致 Apert 道中，用全身表達的 Cre 小鼠 EIIa-Cre 與 FGFR鼠（即 EIIa-FGFR2+/P253R，簡稱 EIIa-253）比野生的顱骨尺寸更短、顱骨左右軸寬度增加、上下高型小鼠相比，Col2a1-253 小鼠的壽命表現(xiàn)正常， 1-1），，身長、尾長也無異常（圖 1-2）。對其股骨（圖 1-3）。

圖 1-2 Col2a1-253 及 WT 小鼠身長Figure 1-2. The tail lengths of Col2a1-253 and WT mice圖 1-3 Col2a1-253 及對照 WT 小鼠股骨脛骨長度(A) 脛骨股骨；(B) 長度統(tǒng)計e 1-3. The lengths of tibia and femur of Col2a1-253 and W
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R596

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本文編號：2646006