【摘要】：目的:探討葡萄糖激酶(Glucokinase,GCK)基因突變所致的青少年起病的成人型糖尿病2型(Maturity-onset diabetes of the young type2,MODY2)的臨床特點和分子遺傳學特征及新型GCK基因I404N突變致病的分子機制。方法:1.對滿足MODY2分子遺傳學檢測臨床標準的1例患者及其家系行外顯子聚合酶鏈式反應(PCR)擴增、測序。2.對100個健康個體GCK基因座的兩個等位基因進行驗證分析。3.通過基因合成、載體表達構建(帶谷胱甘肽S轉移酶(Glutathione S transferase,GST)標簽)、大腸桿菌(Escherichia Coli,E.Coli)細胞表達、蛋白純化,得到純度良好的野生型及突變型GST-GCK重組蛋白。4.通過酶偶聯分析法進行酶功能學研究。4.1酶動力學分析 在4mmol·L~(-1) ATP存在下,取終濃度0.4~150mmol·L~(-1)間的不同濃度葡萄糖稀釋液或在100mmol·L~(-1)葡萄糖存在下,取0.02~4mmol·L~(-1)間的不同濃度ATP稀釋液,分光光度法連續(xù)測定反應的吸光度值。采用SigmaPlot 13.0酶動力學分析軟件計算酶動力學參數。4.2熱穩(wěn)定性分析 將一定量的野生型和突變型GCK蛋白分別在25,30,37,45,50,55,60℃的水浴鍋中孵育30分鐘或分別在55℃下孵育5,10,15,20,25,30分鐘,分光光度法連續(xù)測定反應的吸光度值。4.3最適PH分析 將一定量的野生型和突變型GCK蛋白分別在PH值為6.8,7.0,7.4,7.5,8.0,8.8的Tris-HCL緩沖液中處理30分鐘,分光光度法連續(xù)測定反應的吸光度值。5.統(tǒng)計學分析計量資料以均數±標準差描述其特征,兩組間比較采用t檢驗或非參數Mann-Whitney檢驗。采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 21.0處理數據。雙側P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結果:1.基因測序發(fā)現先證者及其父親存在GCK基因I404N突變,該突變未見報導。2.對來自100個健康個體的GCK基因座的兩個等位基因進行驗證分析,作為對照均未檢測到該突變。3.與野生型GCK蛋白相比,突變型GCK蛋白產量下降。4.酶動力學分析顯示:與野生型GCK蛋白相比,突變型GCK蛋白發(fā)生改變,S_(0.5)值升高了2.9倍,葡萄糖拐點上升了4.9倍,ATP-K_m值升高了7.9倍,K_(cat)下降至野生型的6.1%,相對活性指數下降至野生型的0.2%。5.熱穩(wěn)定性分析顯示:與野生型GCK蛋白相比,突變型GCK蛋白隨著孵育溫度升高或孵育時間延長酶活性明顯下降。6.最適PH分析顯示:與野生型GCK蛋白相比,突變型GCK蛋白在PH影響下酶活性發(fā)生明顯改變且在人體常態(tài)(PH7.4-7.5)條件下,酶活性最低。結論:1.我們首次發(fā)現了GCK基因I404N突變家系,且突變與高血糖共分離。2.GCK基因I404N突變導致酶與葡萄糖、ATP的親和力下降、熱穩(wěn)定性下降和最適PH值改變,從而導致先證者糖代謝紊亂。
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1

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本文編號：2643681