【摘要】：第一部分體內(nèi)研究高血糖對(duì)肝內(nèi)S1P/S1PRS系統(tǒng)的影響,并進(jìn)一步研究激活的S1P-S1PR3信號(hào)通路對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的影響目的:體內(nèi)研究高血糖對(duì)S1P/S1PRS系統(tǒng)的影響,并進(jìn)一步探索激活的S1P-S1PR3信號(hào)通路對(duì)高糖加重肝臟缺血再灌注損傷的影響。方法:招募肝臟良性疾病實(shí)行肝切除的糖尿病病人,并采用鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法構(gòu)建高血糖小鼠模型。接著分別利用高血糖小鼠和正常小鼠建立70%肝臟缺血90分鐘再灌注6,24h的動(dòng)物模型,并用假手術(shù)組作為對(duì)照(shame組)。通過(guò)Quantitative RT-PCR(qRT-PCR),Western blot和ELISA方法檢測(cè)S1P/S1PRS系統(tǒng)中各個(gè)分子在各組中的表達(dá)情況。根據(jù)檢測(cè)情況,單獨(dú)建立70%肝臟缺血90分鐘再灌注后6h的動(dòng)物模型,并于再灌注前分別對(duì)高血糖小鼠和正常小鼠腹腔注射S1PR3抑制劑CAY-10444(1mg/kg);我們?cè)诓煌〗M分別檢測(cè)了小鼠ALT,AST,炎癥基因表達(dá)及肝組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況;并用qRT-PCR,Western blot以及免疫熒光等方法檢測(cè)了與巨噬細(xì)胞M1/M2極化相關(guān)的表面分子和標(biāo)志性通路。結(jié)果:與血糖正常者相比,糖尿病患者或者高血糖小鼠中S1P水平均明顯增高。S1PR3,而不是S1PR1和S1PR2,在高血糖刺激下在肝組織和KCs中被特異性激活。S1PR3拮抗劑CAY-10444可以降低高血糖小鼠缺血再灌注后的肝臟酶學(xué)指標(biāo)(ALT,AST),肝臟組織炎癥浸潤(rùn)(巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn))和血清促炎因子(TNF-α,IL-6)釋放,從而減弱高血糖惡化的肝臟缺血再灌注損傷。qRT-PCR和Western blot結(jié)果還顯示高血糖小鼠肝臟在缺血再灌注前后都表達(dá)較高水平的M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子和低水平的M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子;熒光雙染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)高血糖促進(jìn)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的M1(CD68/CD86)分化并抑制其M2(CD68/CD206)分化。更重要的是,CAY10444可以逆轉(zhuǎn)上述高血糖調(diào)節(jié)的M1/M2極化,它能夠促進(jìn)肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞的M2型極化并抑制巨噬細(xì)胞的M1型極化。結(jié)論:高血糖特異性激活了S1P-S1PR3信號(hào)通路,該激活的信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的M1/M2極化增加炎癥反應(yīng)從而加重肝臟缺血再灌注損傷第二部分體外研究高糖對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)S1P-S1PR3信號(hào)通路的影響,并進(jìn)一步探索S1P-S1PR3通路加重炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制目的:體外驗(yàn)證高血糖激活S1P-S1PR3信號(hào)軸,并進(jìn)一步研究該通路是否通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞M1/M2極化加重炎癥反應(yīng)。方法:提取小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs),分別在低糖(LG)培養(yǎng)基(5mM)或高糖(HG)培養(yǎng)基(30 mM)的條件下將BMDMs培養(yǎng)分化7天,設(shè)為L(zhǎng)G組和HG組;接著分別對(duì)兩組加LPS(1ug/ml)刺激,設(shè)為HG+LPS組和LG+LPS組。最后我們采用S1PR3 siRNA和對(duì)照組(NS)siRNA分別對(duì)高糖BMDMs進(jìn)行干擾轉(zhuǎn)染,抑制S1PR3表達(dá)后加用LPS刺激,設(shè)為HG+LPS/S1PR3組和HG+LPS/NC組。我們分別于刺激后的0h,2h,6h,12h和24h收集上述各組細(xì)胞的細(xì)胞上清及細(xì)胞蛋白。用qRT-PCR,Western blot和ELISA等方法進(jìn)一步研究高血糖激活的S1P-S1PR3信號(hào)通路對(duì)體外巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和巨噬細(xì)胞M1/M2極化的影響。結(jié)果:在體外,高血糖激活了骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDMs)內(nèi)的S1P-S1PR3信號(hào)通路。在加入LPS刺激后,高糖BMDMs內(nèi)S1P-S1PR3軸激活更加明顯;與低糖BMDMs相比,高糖BMDMs在LPS刺激后TNF-α和IL-6等促炎癥因子分泌明顯增加,而IL-10等抑炎因子明顯下降;相比之下,S1PR3敲低的高糖BMDMs明顯降低了TNF-α和IL-6等促炎癥因子分泌,而IL-10等抑炎的分泌相對(duì)增加。同時(shí)S1PR3敲低的高糖BMDMs內(nèi)STAT1活化(磷酸化)明顯降低,但STAT3和STAT6的活化明顯增加。結(jié)論:體外高糖同樣激活了巨噬細(xì)胞內(nèi)的S1P-S1PR3信號(hào)通路,S1P-S1PR3軸通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1型極化并抑制M2極化加重體外巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R587.1;R657.3

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