【摘要】：目的:血中孕激素和雌激素水平與2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)胰島素抵抗的發(fā)生密切相關,但目前孕激素和雌激素聯(lián)用在2型糖尿病胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中的相互作用和機制仍不明確。本文通過高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)建立T2DM小鼠胰島素抵抗模型,探討黃體酮和雌二醇聯(lián)用在T2DM胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展中的相互作用和關系,為T2DM胰島素抵抗的診斷和治療提供理論依據(jù)。方法:通過高脂飲食喂養(yǎng)去勢小鼠4周,腹腔注射不同劑量STZ構(gòu)建T2DM小鼠胰島素抵抗模型,測定小鼠空腹血糖,STZ處理后4周,進行糖耐量(Glucose Tolerance,GTT)和胰島素抵抗實驗(Insulin Tolerance Tests,ITT),同時采用灌流實驗檢測不同組小鼠離體組織的耗糖量,以確定T2DM胰島素抵抗小鼠模型構(gòu)建成功的最佳方案。模型構(gòu)建方案確定后,另購置小鼠,去勢并高脂飲食喂養(yǎng)4周,隨機分為對照組、模型組和給藥組。給藥組腹腔注射STZ的同時皮下注射黃體酮或17β-雌二醇。每周測量小鼠空腹血糖,性激素處理四周后進行GTT、ITT和離體心肌、腓腸肌和肝臟灌流實驗。采用ELISA分析血胰島素、C肽、血肝細胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)水平。取部分組織分別固定和冰凍,采用HE染色檢測胰島形態(tài)和胰島細胞數(shù)量,利用qPCR和免疫熒光技術檢測小鼠肝臟和骨骼肌中胰島素受體、胰島素受體底物-1(Insulin receptor Substrate-1,IRS-1)和胰島素受體底物-2(Insulin receptor Substrate-2,IRS-2)的表達。結(jié)果:高脂飲食聯(lián)合不同劑量STZ構(gòu)建T2DM胰島素抵抗小鼠模型的最佳造模方法為高脂飲食喂養(yǎng)4周后,腹腔注射STZ 30 mg/kg體重,連續(xù)3天,第四天腹腔注射STZ 80 mg/kg體重。T2DM胰島素抵抗小鼠飲水量和進食量明顯增加,尿糖呈現(xiàn)陽性,體重降低,血糖明顯升高;糖耐量受損,胰島素分泌量和胰島素抵抗指數(shù)顯著增加,外周組織對胰島素敏感性明顯下降,HGF水平顯著升高,模型小鼠出現(xiàn)了明顯的胰島素抵抗;胰島β細胞受到損傷,功能明顯下降,胰島形態(tài)發(fā)生改變,胰島細胞數(shù)量顯著增加,出現(xiàn)了增生現(xiàn)象;無論在生理糖水平或高糖水平下進行灌流,離體心肌、腓腸肌和肝臟的基礎耗糖量和在外源性胰島素作用下的耗糖量均顯著降低;小鼠肝臟胰島素受體、IRS-1和IRS-2表達明顯下調(diào),骨骼肌胰島素受體和IRS-1表達也下調(diào)。黃體酮8 mg/kg體重可以降低模型小鼠血糖,增加外周組織對胰島素的敏感性,改善糖耐量,緩解胰島素抵抗,延緩小鼠T2DM的發(fā)生,還可使小鼠肝臟IRS-2和骨骼肌IRS-1的表達顯著上調(diào);但三種劑量的黃體酮(0.1、2或8 mg/kg體重)使胰島明顯萎縮、胰島細胞的功能明顯受損;黃體酮0.1 mg/kg體重下調(diào)了肝臟IRS-1的表達,上調(diào)了肝臟IRS-2的表達,對肝臟中胰島素受體表達無明顯影響。17β-雌二醇0.1 mg/kg體重可以降低模型小鼠血糖和胰島素抵抗指數(shù),增強外周組織對胰島素敏感性,改善糖耐量和胰島素抵抗,減弱模型小鼠胰島的增生,對胰島細胞有保護作用;還可上調(diào)小鼠肝臟胰島素受體IRS-1和IRS-2的表達,明顯延緩高脂飼料聯(lián)合STZ誘發(fā)的T2DM小鼠胰島素抵抗的發(fā)生。皮下注射黃體酮8 mg/kg體重,可通過降低血糖、改善糖耐量和延緩胰島素抵抗及上調(diào)肝臟胰島素受體蛋白的表達,協(xié)同17β-雌二醇的抗糖尿病作用;相反,0.1 mg/kg體重黃體酮則通過下調(diào)肝臟和骨骼肌胰島素受體、IRS-2的表達拮抗17β-雌二醇延緩T2DM的發(fā)生作用,加重了糖耐量損傷和胰島素抵抗。結(jié)論:1.高脂飲食聯(lián)合STZ誘導的2型糖尿病小鼠出現(xiàn)了嚴重的胰島素抵抗。2.黃體酮對糖尿病的發(fā)生表現(xiàn)出雙重作用:一方面通過萎縮胰島,減少胰島細胞數(shù)量,促進糖尿病的發(fā)生;另一方面通過增加外周組織對胰島素的敏感性,改善糖耐量,緩解胰島素抵抗,延緩T2DM胰島素抵抗的發(fā)生。3.17β-雌二醇可通過保護胰島細胞、上調(diào)肝臟胰島素受體、IRS-1和IRS-2的表達改善胰島素抵抗,延緩T2DM的發(fā)生。4.黃體酮8 mg/kg體重具有協(xié)同17β-雌二醇延緩T2DM胰島素抵抗發(fā)生的作用,而黃體酮0.1 mg/kg體重與17β-雌二醇聯(lián)用表現(xiàn)出一定的拮抗效應。
【圖文】：

Fig. 2 The contracting activity of isolated myocardium in mice圖 2 小鼠離體心肌的收縮活動(A): The Rhythm contraction of isolated mice myocardium. (B): The contraction of imice myocardium after stimulation.2.2.4.2 離體腓腸肌灌流實驗處死小鼠，取小鼠左腿置于供有混合氣體并含有 K-H 溶液的培養(yǎng)皿中斷結(jié)締組織與神經(jīng)分支，分離出腓腸肌用鋅銅弓檢查腓腸肌的興奮性，一線結(jié)扎與雙極電極連接，另一端縛線結(jié)扎肌腱并連接至張力傳感器，以 11 ms 和閾值（15 ± 5V）的電刺激刺激腓腸肌，溫育 20 min，，采用 BL-420S信號采集系統(tǒng)記錄腓腸肌收縮活動，同時在換液和加入胰島素前后 0 mimin，60min，90 min 測肌槽中糖濃度，記錄不同處理組小鼠離體腓腸肌在糖水平和高糖水平時胰島素處理前后的耗糖量。

Fig. 2 The contracting activity of isolated myocardium in mice圖 2 小鼠離體心肌的收縮活動(A): The Rhythm contraction of isolated mice myocardium. (B): The contraction of isolatedmice myocardium after stimulation.2.2.4.2 離體腓腸肌灌流實驗處死小鼠，取小鼠左腿置于供有混合氣體并含有 K-H 溶液的培養(yǎng)皿中，剪斷結(jié)締組織與神經(jīng)分支，分離出腓腸肌用鋅銅弓檢查腓腸肌的興奮性，一端縛線結(jié)扎與雙極電極連接，另一端縛線結(jié)扎肌腱并連接至張力傳感器，以 1 Hz、1 ms 和閾值（15 ± 5V）的電刺激刺激腓腸肌，溫育 20 min，采用 BL-420S 生物信號采集系統(tǒng)記錄腓腸肌收縮活動，同時在換液和加入胰島素前后 0 min，30min，60min，90 min 測肌槽中糖濃度，記錄不同處理組小鼠離體腓腸肌在生理糖水平和高糖水平時胰島素處理前后的耗糖量。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1

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