【摘要】：目的:物質(zhì)生活的豐富與人類壽命的延長,使得慢性疾病對健康的威脅愈發(fā)占據(jù)突出地位。其中,糖尿病是一種典型代表性疾病。糖尿病性骨質(zhì)疏松是糖尿病的重要并發(fā)癥之一,骨質(zhì)疏松病的特點為骨吸收增多,同時骨形成減少,造成骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)改變導致骨質(zhì)脆性增加和骨折風險增高。高糖血癥是1型和2型糖尿病的共同特點,其可能是增加骨折風險的因素。普遍觀點認為葡萄糖能促進破骨細胞分化并增強其功能,但是,一部分學者的研究表明高糖會對破骨細胞起到抑制作用。因此,在高糖對于破骨細胞的影響問題上仍然存在爭議。自噬是一種主要負責消除受損蛋白和細胞器的過程,現(xiàn)在被廣泛認為是一種抗衰老程序。并且,自噬也被認為是一種維持細胞穩(wěn)態(tài)的應(yīng)激反應(yīng)機制。自噬在破骨細胞中也起著重要作用。自噬蛋白Beclin-1通過誘導ROS和NFATc1基因的表達來作用于RANKL相關(guān)破骨細胞分化,同時,敲除Atg5,Atg7和LC3的破骨細胞出現(xiàn)細胞特異性蛋白CTSK的分泌和特異性皺褶結(jié)構(gòu)形成的減弱。AMPK通路是一條主要的代謝調(diào)控通路,其激活與否與葡萄糖的多寡相關(guān)。同時,該通路可以通過調(diào)控下游mTORC1與ULK1元件對細胞自噬發(fā)揮作用。因此,本課題主要通過研究高糖環(huán)境對破骨分化和功能的影響,以及自噬在高糖環(huán)境下破骨細胞分化與功能變化中的作用,同時觀察相關(guān)信號通路的變化情況,探討高糖環(huán)境影響破骨細胞分化和功能方面的分子機制。研究方法:使用CCK8試劑檢測不同濃度(5.5,10.5,15.5,20.5,25.5,和30.5mM/L)的葡萄糖以及不同時間點(第1至第6天)對RAW264.7細胞活力的影響;使用Western Blotting法檢測不同糖濃度對誘導至第四天的破骨細胞組織蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)表達水平;使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒檢測不同糖濃度對誘導至第四天的破骨細胞個數(shù)的影響;使用羥基磷灰石基質(zhì)骨吸收孔板檢測不同糖濃度對誘導至第四天的破骨細胞吸收能力的影響。使用Western Blotting法檢測低糖、高糖以及相應(yīng)濃度添加AMPK通路抑制劑Compound C下誘導至第四天的破骨細胞AMPK通路相關(guān)蛋白p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1和ULK1表達情況,同時檢測此條件下自噬相關(guān)蛋白LC3I/LC3II和P62表達情況;使用Western Blotting法檢測低糖(5.5mM/L)和高糖(30.5mM/L)濃度下誘導至第四天的破骨細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3I/LC3II和P62的表達情況;使用透射電子顯微鏡觀察低糖和高糖濃度下誘導至第四天的破骨細胞自噬體數(shù)量情況;使用免疫熒光染色觀察低糖和高糖濃度下誘導至第四天的破骨細胞內(nèi)源性點簇狀LC3聚集情況;使用Western Blotting法檢測自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和巴佛羅霉素A1(Bafilomycin A1,BafA1)以及自噬激動劑雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)作用下誘導至第四天的破骨細胞自噬相關(guān)蛋白LC3I/LC3II和P62以及破骨功能蛋白CTSK表達情況;同時使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒檢測此條件下對誘導至第四天的破骨細胞個數(shù)的影響。結(jié)果:從5.5mM/L至30.5mM/L的6組不同糖濃度培養(yǎng)基對RAW264.7細胞活力無顯著影響,但是發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的增加,破骨細胞功能蛋白CTSK表達逐漸下降,破骨細胞形成個數(shù)與骨吸收面積逐漸減少;低糖(5.5mM/L)和高糖(30.5mM/L)誘導培養(yǎng)基誘導破骨細胞形成4天后,與低糖環(huán)境相比,高糖條件下破骨細胞AMPK/mTOR/ULK1信號通路表達水平受抑制,同時使用AMPK通路抑制劑Compound C可以抑制低糖或高糖環(huán)境下自噬蛋白LC3II的表達,增加P62的表達;低糖及高糖環(huán)境誘導破骨細胞形成4天后發(fā)現(xiàn)低糖環(huán)境下自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3II表達增強,P62表達減弱,透射電子顯微鏡與免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)低糖環(huán)境下破骨細胞自噬體數(shù)量高于高糖環(huán)境下的數(shù)量;利用自噬抑制劑3-MA和bafA1以及自噬激動劑Rapa作用于破骨細胞形成過程,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,3-MA和bafA1可以抑制CTSK表達與破骨細胞形成數(shù)量,而Rapa可以促進CTSK的表達與破骨細胞形成數(shù)量。結(jié)論:1、糖濃度的變化不影響RAW264.7細胞活力,但是高糖會抑制破骨細胞形成與功能。2、AMPK/mTOR/ULK1信號通路在高糖環(huán)境下被抑制,同時該通路參與調(diào)控破骨細胞自噬的過程。3、高糖環(huán)境會抑制破骨細胞形成過程中的自噬水平,進而減弱破骨細胞形成與功能。
【圖文】：

2.2.8 統(tǒng)計學分析獲取的數(shù)據(jù)由軟件 SPSS19.0 進行統(tǒng)計分析。組間比較使用單因素方差分析，方差一致性檢驗用 Levene 檢驗方法，組間比較使用 SNK 方法。p≤0.05 認為差異具有統(tǒng)計學意義，p≤0.01 認為統(tǒng)計學差異非常顯著，其余則無統(tǒng)計學意義。3 結(jié)果3.1 不同糖濃度對 RAW264.7 細胞活力的影響為了明確糖濃度的變化對破骨前體細胞的影響，我們通過調(diào)整培養(yǎng)基使最終糖濃度為 5.5、10.5、15.5、20.5、25.5 和 30.5mM/L 后，培養(yǎng) RAW264.7 細胞 6 天，并每天在固定時間隨機抽取一塊 96 孔板檢測細胞活力(圖 3.1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖濃度在6 天時間內(nèi)對 RAW264.7 細胞活力無顯著影響。

中國醫(yī)科大學碩士學位論文因素方差分析和 LSD 法，兩組間比較采用 t 檢驗；NS:各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。3.2 不同糖濃度對破骨細胞功能蛋白表達的影響為了探究糖濃度的變化對 RAW264.7 細胞破骨形成的影響，我們通過調(diào)整培養(yǎng)基使最終糖濃度為 5.5、10.5、15.5、20.5、25.5 和 30.5mM/L 后，誘導 RAW264.7細胞向破骨細胞形成，并在第四天結(jié)束誘導。通過蛋白免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度增加，破骨細胞功能蛋白 CTSK 表達水平逐漸減弱（圖 3.2）。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2;R580

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 徐飛;葉亞平;董永輝;郭風勁;陳安民;黃仕龍;;Inhibitory Effects of High Glucose/Insulin Environment on Osteoclast Formation and Resorption in vitro[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年02期

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本文編號：2639315