【摘要】：背景:隨著生活水平的提高,全世界肥胖人群逐年增多,其中能量攝入過(guò)多是導(dǎo)致肥胖的最主要原因。長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致一些臟器的改變,例如肝臟、大腦、心臟等。在骨組織,高脂飲食會(huì)引起的骨髓脂肪組織(BMAT)的增多,影響骨的自穩(wěn)性和骨的再生,近年來(lái)到關(guān)注。BMAT作為“新”脂肪庫(kù)出現(xiàn),占成年人總脂肪量的5%,而B(niǎo)MAT作為一種獨(dú)特的脂肪庫(kù),其重要性已在骨脂相互作用中得到證實(shí)。而其中脂肪組織作為內(nèi)分泌器官所分泌的脂肪因子引起了很大的作用。最近有一些研究發(fā)現(xiàn),脂肪組織所分泌的脂肪因子,在骨組織形成以及代謝過(guò)程中有著重要作用,脂肪因子可以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過(guò)程,調(diào)節(jié)其成骨分化及成脂分化的方向來(lái)影響骨的形成。脂肪因子家族包括有瘦素、脂聯(lián)素、分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(secreted Frizzled-related protein 5,s FRP5)等,其中s FRP5還是Wnt信號(hào)通路的抑制劑,一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高脂飲食導(dǎo)致的肥胖小鼠,骨骼,血清中s FRP5表達(dá)明顯增高。本研究目的在于檢測(cè)高脂飲食小鼠骨組織中s FRP5的表達(dá)與骨組織變化的相關(guān)性,s FRP5對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨分化的調(diào)節(jié),以探求BMAT中的s FRP5在高脂飲食引起的骨組織的改變中的作用。同時(shí)我們也檢測(cè)了高脂飲食肥胖小鼠骨內(nèi)自噬水平的變化,以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程中自噬水平的改變。第一部分:高脂飲食對(duì)小鼠骨骼結(jié)構(gòu)的影響以及s FRP5的表達(dá)目的:構(gòu)建高脂飲食肥胖小鼠并檢測(cè)骨組織結(jié)構(gòu)變化與s FRP5相關(guān)性方法:選取4周齡健康雄性小鼠40只,其中C57BL"6小鼠20只,ob/ob小鼠20只。分為高脂飲食組及正常飲食組喂養(yǎng)。進(jìn)行喂養(yǎng)10周,喂養(yǎng)過(guò)程中每周測(cè)量體重。喂養(yǎng)結(jié)束后收取血清檢測(cè)血糖,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,甘油三脂等生化指標(biāo)。測(cè)量體長(zhǎng),肝重、脂肪重、體重并取材,分離取出一側(cè)股骨固定,進(jìn)行Micro-CT檢測(cè)后對(duì)股骨脫鈣并包埋,制作成骨切片進(jìn)行Alcian Blue、HE和Masson染色以及免疫組化,進(jìn)行觀察及對(duì)比。另一側(cè)骨組織凍于液氮中,擇期提取骨組織的RNA,進(jìn)行PCR。檢測(cè)s FRP5及相關(guān)因子進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果:高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠組在喂養(yǎng)10周后體重及身長(zhǎng)遠(yuǎn)大于對(duì)照組(P0.05)。生化指標(biāo)高脂組遠(yuǎn)高于對(duì)照組(P0.05)。肥胖小鼠模型構(gòu)建成功。通過(guò)Micro CT檢測(cè)股骨骨量,結(jié)果示與高脂組相比于正常喂養(yǎng)組骨量及骨小梁等明顯降低(P0.05),ob/ob小鼠高脂喂養(yǎng)后,體重增加更快,骨量下降更明顯。HE,Alcian Blue,Masson染色結(jié)果顯示高脂喂養(yǎng)后骨小梁降低,膠原生成減少,骨髓腔中的脂肪組織增多。PCR及免疫組化結(jié)果顯示高脂組骨組織和骨髓腔中s FRP5的表達(dá)增高,成脂相關(guān)因子表達(dá)增高。結(jié)論:高脂飲食引起小鼠骨量降低,BMAT增加,骨組織中s FRP5的表達(dá)增高,ob/ob小鼠變化更為明顯。第二部分:檢測(cè)s FRP5對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用及機(jī)制探討目的:分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并鑒定,探討s FRP5對(duì)于小鼠骨髓間充質(zhì)分化的影響及其作用的機(jī)制方法:從4周齡雄性小鼠股骨中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察其細(xì)胞形態(tài),體外培養(yǎng)傳代后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記,體外培養(yǎng)后進(jìn)行成脂成骨誘導(dǎo),并采取油紅O染色檢測(cè)脂滴;ALP和茜素紅檢測(cè)成骨情況。將鑒定好的細(xì)胞體外繼續(xù)培養(yǎng),按照RFP+ODM,s FRP5+ODM,RFP+NM,s FRP5+NM進(jìn)行分組,處理7d后進(jìn)行ALP染色,處理14d后進(jìn)行油紅O染色,茜素紅染色。染色同日提取四組RNA及蛋白,分別采取PCR,Western blot檢測(cè)成骨成脂因子以及Wnt信號(hào)通路相關(guān)表達(dá)。結(jié)果:體外誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞形成和高脂飲食小鼠的脂肪組織中,s FRP5的表達(dá)均明顯增加,s FRP5能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。成骨誘導(dǎo)后,BMMSC的ALP染色和茜素紅染色均明顯增加,s FRP5能抑制ALP染色和茜素紅染色。s FRP5能上調(diào)成脂轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和相關(guān)脂肪因子的表達(dá),并下調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2和成骨相關(guān)因子的表達(dá)。成骨誘導(dǎo)能激活BMMSC中Wnt經(jīng)典信號(hào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性,β-catenin蛋白的表達(dá)及其Ser675位點(diǎn)磷酸化水平明顯升高,s FRP5抑制BMMSC成骨分化中Wnt經(jīng)典信號(hào)的激活,β-catenin蛋白的表達(dá)及其Ser675位點(diǎn)磷酸化水平收到抑制。結(jié)論:s FRP5能調(diào)節(jié)BMMSC的分化平衡,促進(jìn)成脂分化,抑制成骨分化,與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。第三部分:自噬在高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠骨骼的作用探討目的:探求高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中骨骼自噬變化的水平以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程中自噬的變化。方法:PCR檢測(cè)高脂肥胖小鼠骨內(nèi)自噬相關(guān)因子Beclin-1和LC3的表達(dá),免疫組化檢測(cè)骨內(nèi)Beclin-1表達(dá)。培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分為成脂培養(yǎng)基、成骨培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基進(jìn)行處理,電鏡下觀察自噬小體。m RFP-e GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,激光共聚焦下觀察。提取3組蛋白,Westernblot檢測(cè)三組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。3MA(自噬抑制劑)處理三組細(xì)胞后,油紅及茜素紅染色觀察其成脂和成骨能力的改變。結(jié)果:高脂喂養(yǎng)后自噬相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)高脂飲食后骨內(nèi)Beclin-1和LC3表達(dá)明顯增加,組化結(jié)果顯示高脂組骨內(nèi)Beclin-1表達(dá)增加。電鏡顯示成脂誘導(dǎo)后自噬小體明顯增多,成骨誘導(dǎo)的自噬小體也有一定增多。Western-blot顯示成脂培養(yǎng)誘導(dǎo)后Beclin-1和LC3II/I的表達(dá)比例增加,P62的表達(dá)下降。成骨培養(yǎng)誘導(dǎo)后LC3II/I的表達(dá)比例增加也有增加。轉(zhuǎn)染m RFP-e GFP-LC3質(zhì)粒后,成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞中綠色和紅色亮點(diǎn)數(shù)量均明顯增加,成骨誘導(dǎo)后亮點(diǎn)數(shù)量增加相對(duì)較少。3MA作用后油紅染色及茜素紅染色減少。結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)小鼠骨組織內(nèi)自噬水平增加。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨分化中自噬水平增加,成脂分化增加尤為明顯。抑制自噬能抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成脂分化。
【圖文】：

圖 1.1 四組小鼠高脂及普通飲食喂養(yǎng) 9 周后體重的變化。A：大體圖(a 為 C57BL/6J 高脂組，b 為 C57BL/6J 喂養(yǎng)組，c ob/ob 高脂組，，d ob/ob 正常喂養(yǎng)組)。 B：體重變化Fig1.1 Four groups mouse were fed for 9 weeks.A.Appearance (a C57BL/6J mouse for HFD, bC57BL/6J mouse for NCD, c ob/ob mouse for HFD, d ob/ob mouse for NCD). B. The change ofweights. *p<0.05, **p<0.01, **p<0.001

圖 1.2 骨組織 MicroCT 掃描及分析Figure 1.2 MicroCT scanning and analysis of bone. *p <0.052.4 四組骨組織的骨組織化學(xué)染色結(jié)果骨組織固定后，經(jīng)脫鈣包埋切片處理后，分別進(jìn)行 HE 染色、Alcian Blue 染
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R589.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 Thitiya Poonpet;Sittisak Honsawek;;Adipokines: Biomarkers for osteoarthritis?[J];World Journal of Orthopedics;2014年03期

本文編號(hào)：2638360