【摘要】：背景:隨著生活水平的提高,全世界肥胖人群逐年增多,其中能量攝入過多是導致肥胖的最主要原因。長期高脂飲食會導致一些臟器的改變,例如肝臟、大腦、心臟等。在骨組織,高脂飲食會引起的骨髓脂肪組織(BMAT)的增多,影響骨的自穩(wěn)性和骨的再生,近年來到關注。BMAT作為“新”脂肪庫出現(xiàn),占成年人總脂肪量的5%,而BMAT作為一種獨特的脂肪庫,其重要性已在骨脂相互作用中得到證實。而其中脂肪組織作為內分泌器官所分泌的脂肪因子引起了很大的作用。最近有一些研究發(fā)現(xiàn),脂肪組織所分泌的脂肪因子,在骨組織形成以及代謝過程中有著重要作用,脂肪因子可以調控骨髓間充質干細胞的分化過程,調節(jié)其成骨分化及成脂分化的方向來影響骨的形成。脂肪因子家族包括有瘦素、脂聯(lián)素、分泌型卷曲相關蛋白5(secreted Frizzled-related protein 5,s FRP5)等,其中s FRP5還是Wnt信號通路的抑制劑,一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高脂飲食導致的肥胖小鼠,骨骼,血清中s FRP5表達明顯增高。本研究目的在于檢測高脂飲食小鼠骨組織中s FRP5的表達與骨組織變化的相關性,s FRP5對骨髓間充質干細胞成脂和成骨分化的調節(jié),以探求BMAT中的s FRP5在高脂飲食引起的骨組織的改變中的作用。同時我們也檢測了高脂飲食肥胖小鼠骨內自噬水平的變化,以及骨髓間充質干細胞分化過程中自噬水平的改變。第一部分:高脂飲食對小鼠骨骼結構的影響以及s FRP5的表達目的:構建高脂飲食肥胖小鼠并檢測骨組織結構變化與s FRP5相關性方法:選取4周齡健康雄性小鼠40只,其中C57BL"6小鼠20只,ob/ob小鼠20只。分為高脂飲食組及正常飲食組喂養(yǎng)。進行喂養(yǎng)10周,喂養(yǎng)過程中每周測量體重。喂養(yǎng)結束后收取血清檢測血糖,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,甘油三脂等生化指標。測量體長,肝重、脂肪重、體重并取材,分離取出一側股骨固定,進行Micro-CT檢測后對股骨脫鈣并包埋,制作成骨切片進行Alcian Blue、HE和Masson染色以及免疫組化,進行觀察及對比。另一側骨組織凍于液氮中,擇期提取骨組織的RNA,進行PCR。檢測s FRP5及相關因子進行對比。結果:高脂飲食誘導的小鼠組在喂養(yǎng)10周后體重及身長遠大于對照組(P0.05)。生化指標高脂組遠高于對照組(P0.05)。肥胖小鼠模型構建成功。通過Micro CT檢測股骨骨量,結果示與高脂組相比于正常喂養(yǎng)組骨量及骨小梁等明顯降低(P0.05),ob/ob小鼠高脂喂養(yǎng)后,體重增加更快,骨量下降更明顯。HE,Alcian Blue,Masson染色結果顯示高脂喂養(yǎng)后骨小梁降低,膠原生成減少,骨髓腔中的脂肪組織增多。PCR及免疫組化結果顯示高脂組骨組織和骨髓腔中s FRP5的表達增高,成脂相關因子表達增高。結論:高脂飲食引起小鼠骨量降低,BMAT增加,骨組織中s FRP5的表達增高,ob/ob小鼠變化更為明顯。第二部分:檢測s FRP5對骨髓間充質干細胞分化的作用及機制探討目的:分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞并鑒定,探討s FRP5對于小鼠骨髓間充質分化的影響及其作用的機制方法:從4周齡雄性小鼠股骨中分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞,觀察其細胞形態(tài),體外培養(yǎng)傳代后進行流式細胞術檢測細胞表面分子標記,體外培養(yǎng)后進行成脂成骨誘導,并采取油紅O染色檢測脂滴;ALP和茜素紅檢測成骨情況。將鑒定好的細胞體外繼續(xù)培養(yǎng),按照RFP+ODM,s FRP5+ODM,RFP+NM,s FRP5+NM進行分組,處理7d后進行ALP染色,處理14d后進行油紅O染色,茜素紅染色。染色同日提取四組RNA及蛋白,分別采取PCR,Western blot檢測成骨成脂因子以及Wnt信號通路相關表達。結果:體外誘導脂肪細胞形成和高脂飲食小鼠的脂肪組織中,s FRP5的表達均明顯增加,s FRP5能促進間充質干細胞的成脂分化。成骨誘導后,BMMSC的ALP染色和茜素紅染色均明顯增加,s FRP5能抑制ALP染色和茜素紅染色。s FRP5能上調成脂轉錄因子PPARγ和相關脂肪因子的表達,并下調成骨轉錄因子Runx2和成骨相關因子的表達。成骨誘導能激活BMMSC中Wnt經(jīng)典信號的轉錄調節(jié)活性,β-catenin蛋白的表達及其Ser675位點磷酸化水平明顯升高,s FRP5抑制BMMSC成骨分化中Wnt經(jīng)典信號的激活,β-catenin蛋白的表達及其Ser675位點磷酸化水平收到抑制。結論:s FRP5能調節(jié)BMMSC的分化平衡,促進成脂分化,抑制成骨分化,與Wnt/β-catenin信號通路的調節(jié)有關。第三部分:自噬在高脂誘導的肥胖小鼠骨骼的作用探討目的:探求高脂飲食誘導的肥胖小鼠中骨骼自噬變化的水平以及骨髓間充質干細胞分化過程中自噬的變化。方法:PCR檢測高脂肥胖小鼠骨內自噬相關因子Beclin-1和LC3的表達,免疫組化檢測骨內Beclin-1表達。培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞分為成脂培養(yǎng)基、成骨培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基進行處理,電鏡下觀察自噬小體。m RFP-e GFP-LC3質粒轉染細胞后,激光共聚焦下觀察。提取3組蛋白,Westernblot檢測三組自噬相關蛋白表達。3MA(自噬抑制劑)處理三組細胞后,油紅及茜素紅染色觀察其成脂和成骨能力的改變。結果:高脂喂養(yǎng)后自噬相關基因的表達發(fā)現(xiàn)高脂飲食后骨內Beclin-1和LC3表達明顯增加,組化結果顯示高脂組骨內Beclin-1表達增加。電鏡顯示成脂誘導后自噬小體明顯增多,成骨誘導的自噬小體也有一定增多。Western-blot顯示成脂培養(yǎng)誘導后Beclin-1和LC3II/I的表達比例增加,P62的表達下降。成骨培養(yǎng)誘導后LC3II/I的表達比例增加也有增加。轉染m RFP-e GFP-LC3質粒后,成脂誘導后細胞中綠色和紅色亮點數(shù)量均明顯增加,成骨誘導后亮點數(shù)量增加相對較少。3MA作用后油紅染色及茜素紅染色減少。結論:高脂飲食誘導小鼠骨組織內自噬水平增加。骨髓間充質干細胞成脂和成骨分化中自噬水平增加,成脂分化增加尤為明顯。抑制自噬能抑制骨髓間充質干細胞的成骨和成脂分化。
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圖 1.1 四組小鼠高脂及普通飲食喂養(yǎng) 9 周后體重的變化。A：大體圖(a 為 C57BL/6J 高脂組，b 為 C57BL/6J 喂養(yǎng)組，c ob/ob 高脂組，，d ob/ob 正常喂養(yǎng)組)。 B：體重變化Fig1.1 Four groups mouse were fed for 9 weeks.A.Appearance (a C57BL/6J mouse for HFD, bC57BL/6J mouse for NCD, c ob/ob mouse for HFD, d ob/ob mouse for NCD). B. The change ofweights. *p<0.05, **p<0.01, **p<0.001

圖 1.2 骨組織 MicroCT 掃描及分析Figure 1.2 MicroCT scanning and analysis of bone. *p <0.052.4 四組骨組織的骨組織化學染色結果骨組織固定后，經(jīng)脫鈣包埋切片處理后，分別進行 HE 染色、Alcian Blue 染
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R589.2

【參考文獻】

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1 Thitiya Poonpet;Sittisak Honsawek;;Adipokines: Biomarkers for osteoarthritis?[J];World Journal of Orthopedics;2014年03期

本文編號：2638360