【摘要】：第一部分人卵巢組織環(huán)狀RNA的測序與鑒定[目的]環(huán)狀RNA(circRNAs)可通過充當miRNA“海綿”參與多種病理生理過程。然而,人卵巢組織中是否存在circRNA?這些circRNAs在卵巢衰老過程中是否發(fā)揮作用,目前尚未可知。本部分研究的目的是篩選鑒定與卵巢衰老相關(guān)的circRNAs,并預測其潛在的生物學功能。[方法]采集因婦科良性疾病在我院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術(shù)治療的女性患者的卵巢皮質(zhì)組織,時間自2017年2月至2017年10月。對符合測序要求的女性卵巢組織標本進行circRNA高通量測序,鑒定卵巢組織來源circRNA的表達譜。通過qRT-PCR和Sanger測序的方法在大樣本卵巢組織標本中驗證卵巢來源circRNA的存在及測序結(jié)果的可靠性。分子生物學實驗進一步驗證卵巢組織來源circRNAs的一般生物學特征。對差異表達circRNAs進行生物信息學分析,預測其潛在的生物學功能,構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)。[結(jié)果]本研究共采集78例卵巢皮質(zhì)組織,其中,納入6例卵巢組織標本(年輕組20～30歲和高齡40～50歲各3例)進行circRNA高通量測序。測序結(jié)果共檢測到48,220個circRNAs,其中194個circRNAs隨年齡增加呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達,207個circRNAs呈顯著下調(diào)表達(倍數(shù)變化2,P0.05)。qRT-PCR和Sanger測序驗證了這些circRNAs的存在。隨機挑選的8個差異表達circRNAs在較大樣本卵巢組織標本中(n=44)得到了進一步驗證。生物信息學分析表明,這些差異表達circRNAs可能與卵巢衰老相關(guān)的代謝過程相關(guān),如調(diào)節(jié)內(nèi)分泌途徑、氧化還原過程、類固醇激素生物合成和胰島素分泌途徑等信號通路均顯著相關(guān)(P0.05)。我們進一步驗證了卵巢組織來源circRNAs的一般生物學特征,包括反向剪接、耐RNaseR酶消化特性、穩(wěn)定性和可變剪接特性等。生物信息學預測大多數(shù) circRNAs 攜帶 miRNAs 結(jié)合位點,其中circDDX10-miR-1304660-SIRT3軸可能參與卵巢功能的調(diào)節(jié)。[結(jié)論]女性卵巢組織中有大量circRNAs表達,其中一部分circRNAs隨著年齡增高呈現(xiàn)顯著上調(diào)或者下調(diào),可能在卵巢衰老的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。第二部分人卵巢組織來源環(huán)狀RNA在卵泡液顆粒細胞中的表達及其與輔助生殖臨床結(jié)局的相關(guān)性分析[目的]檢測人卵泡液顆粒細胞中circRNAs的表達水平,分析其與女性年齡、BMI、卵巢儲備功能及輔助生殖臨床結(jié)局的相關(guān)性。[方法]收集因不孕癥來我院生殖醫(yī)學中心行輔助生殖技術(shù)治療的女性卵泡液標本239例,時間自2017年10月至2018年7月采用Percoll密度梯度離心法分離提取顆粒細胞,室溫下存放Oh、6h、12h、24h這4個時間點后,qRT-PCR檢測顆粒細胞中circRNAs及其對應(yīng)mRNA的表達情況。同時檢測3個已經(jīng)驗證的差異表達且可能與卵巢功能相關(guān)的circRNAs在人卵泡液顆粒細胞中的表達水平,進一步篩選驗證后,將該circRNA的表達水平與對應(yīng)患者的卵巢儲備功能及輔助生殖臨床結(jié)局作相關(guān)性分析。[結(jié)果]本研究共采集人卵泡液標本239例,分離提取得到顆粒細胞標本210例。在24 h內(nèi),顆粒細胞中的circRNAs表達水平無顯著改變(P0.05),穩(wěn)定性較好,而其。對應(yīng)mRNA迅速降解。在進一步篩選驗證的3個circRNAs中發(fā)現(xiàn),circDDX10在人卵泡液顆粒細胞中的表達水平呈現(xiàn)隨年齡遞增而逐漸下降的趨勢,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),而與BMI未見明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。進一步分析發(fā)現(xiàn),人卵泡液顆粒細胞中circDDX10的表達水平與AMH(r=0.45,P0.01)及 AFC 均呈正相關(guān)(r=0.32,P0.01),但與 FSH 及 E2均未見明顯線性相關(guān)關(guān)系(均為P0.05)。將210例人卵泡液顆粒細胞標本按照circDDX10表達水平的四分位數(shù)(Q1、Q2、Q3、Q4)進行亞組分析,結(jié)果顯示,各組年齡、AMH、AFC及不孕年限有顯著差異(均為P0.01);但BMI、FSH及E2均未見顯著差異(均為P0.05)。Q3、Q4組在獲卵數(shù)方面明顯高于Q1、Q2組(均為P0.01)。各組在正常受精率方面均未見明顯統(tǒng)計學差異(均為P0.05)。在優(yōu)胚率方面,各組之間差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01),其中,Q4組明顯高于Q1組(P0.05)。而在βhCG陽性率及臨床妊娠率方面,各組之間均未見明顯統(tǒng)計學差異(均為P0.05),但總體上與circDDX10的表達水平呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢。[結(jié)論]人卵巢組織來源circRNAs可在人卵泡液顆粒細胞中穩(wěn)定表達,其中circDDX10的表達水平與卵巢儲備功能、獲卵數(shù)和優(yōu)胚率密切相關(guān),有望成為一種有價值的預測輔助生殖結(jié)局的新指標。第三部分人卵巢組織來源環(huán)狀RNA參與卵巢衰老的調(diào)控及初步機制研究[目的]為了進一步闡明卵巢組織來源circRNA——circDDX10對卵巢功能的影響,初步探討circDDX10參與卵巢顆粒細胞衰老的作用機制。[方法]分子生物學實驗進一步驗證卵巢組織來源circRNAs——circDDX10的一般生物學特征。通過構(gòu)建特異的circDDX10沉默(si-circDDX10組)及過表達載體(over-circDDX10組),轉(zhuǎn)染人顆粒細胞系(COV434),無效干擾序列(Negative Control,NC組)及質(zhì)�？蛰d體(Empty Vector,EV組)分別作為對照。qRT-PCR及Westernblot檢測各組凋亡相關(guān)基因/蛋白BAX、BCL-2、CASPASE-3、CASPASE-9的表達水平,TUNEL法檢測各組顆粒細胞凋亡情況。CCK-8試劑盒檢測各組顆粒細胞0h、24 h、48 h、72 h、96 h的細胞增殖活性。qRT-PCR法檢測各組類固醇激素合成相關(guān)基因(CYP11A1、CYP1 7A1、CYP19A1、StAR及HSD1 7B1)的表達水平,試劑盒(化學發(fā)光免疫分析法,CLIA)檢測各組各組培養(yǎng)液上清中雌激素(Estradiol,E2)及孕激素(Progesterone,P)的表達水平。[結(jié)果]circDDX10由DDX10基因7～10號外顯子頭尾反向剪接而成,主要定位于細胞核中。circDDX10具有circRNA的一般生物學特性,即反向剪接、不含PolyA尾、耐RNase R消化、穩(wěn)定不易降解等特點。干擾circDDX10可導致顆粒細胞中凋亡相關(guān)基因BAX、CASPASE-3及CASPASE-9的表達顯著上調(diào)(P0.05),但對抑凋亡基因BCL-2的表達無顯著影響(P0.05),而過表達circDDX10可顯著抑制 CASPASE-3 及 CASPASE-9 的表達(P0.05),但對BAX及BCL-2的表達無顯著影響(P0.05)。與轉(zhuǎn)錄水平的改變相類似,干擾circDDX10可促進顆粒細胞中凋亡相關(guān)蛋白BAX、CASPASE-3及CASPASE-9的表達,而抑制BCL-2蛋白的表達,過表達circDDX10則起相反作用。TUNEL結(jié)果進一步驗證了上述結(jié)果。CCK-8結(jié)果示,干擾circDDX10可導致顆粒細胞增殖活性降低,而過表達circDDX10可誘導顆粒細胞增殖活性升高。干擾circDDX10可顯著抑制類固醇激素合成相關(guān)基因CYP11A1及CYP19A1的表達(P0.05),但對CYP17A1、StAR及HSD1 7B1的表達無明顯抑制作用(P0.05);過表達circDDX10可顯著促進CYP19A1及HSD17B1的表達(P0.05),但對CYP11A1、CYP1 7A1及StAR的表達無明顯改變(P0.05)。各組培養(yǎng)液上清中E2及P的檢測結(jié)果示,circDDX10干擾組E2濃度顯著下調(diào)(P0.01),但對P的濃度無明顯影響(P0.05);相反地,circDDX10過表達組中,E2濃度顯著上調(diào)(P0.01),而P的濃度亦明顯上調(diào)(P0.05)。[結(jié)論]沉默circDDX10可促進顆粒細胞凋亡,抑制顆粒細胞增殖,而過表達circDDX10可起到相反作用。沉默circDDX10可抑制類固醇激素合成相關(guān)基因的表達,而過表達circDDX10可促進類固醇激素合成。circDDX10可能通過影響顆粒細胞增殖凋亡及類固醇激素合成,參與卵巢顆粒細胞功能的調(diào)控。
【圖文】：

測序標本挑選：選取質(zhì)檢合格（總ＲＮＡ片段完整，ＲＩＮ２邋０．７，未出現(xiàn)ＲＮＡ逡逑降解，純度１．８？２．０，濃度ｌＯＯｎｇ／＾ｄ，ＴｏｔａｌＲＮＡ量達到１０w'以上，合格標本電逡逑泳圖示例見圖１）的６例標本Ｃ低齡２０￣３０歲組３例，高齡４０？５０歲組３例）送逡逑公司測序（上海晶能生物有限公司）�；颊咂骄挲g分別為２６．３３±邋１．２５歲和４５逡逑±０．８２歲，患者的基本信息，包括年齡、體重指數(shù)（ＢＭＩ）和基礎(chǔ)性激素水平見逡逑表３。逡逑圖１．電泳圖的Ｃ為標準品，，上樣量為５００邋ｎｇ，圖片顯示為三條清晰的條帶逡逑（２８ｓ／１８ｓ／５ｓ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｔｈｅ邋Ｃ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ邋ｉｓ邋ａ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｗｉｔｈ邋ａ邋ｌｏａｄ邋ｏｆ邋５００邋ｎｇ邋ａｎｄ逡逑ｔｈｅ邋ｆｉｇｕｒｅ邋ｓｈｏｗｓ邋ｔｈｒｅｅ邋ｃｌｅａｒ邋ｂａｎｄｓ邋（２８ｓ／１８ｓ／５ｓ）．逡逑表３．納入本研宄的患者基本信息逡逑Ｔａｂｌｅ邋３．邋Ｂａｓｉｃ邋ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｎｃｌｕｄｅｄ邋ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ邋ｉｎ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ．逡逑．邐Ｓｅｒｕｍ邋ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ邋ｈｏｒｍｏｎｅｓ邋ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ逡逑Ｎｏ．邋Ａｇｅ邋ＢＭＩ邋（ｋｇ／ｍ２）逡逑ＡＭＨ邋（ｎｇ／ｍｌ）邋ＦＳＨ邋（ＩＵ／１）邋ＬＨ邋（ＩＵ／１）邋Ｅ２（ｐｇ／ｍｌ）逡逑２５邐２２．３１邐４Ｊ６邐５＾５７邐４Ｊ７邐４５逡逑２邐２６邐２１．７４邐６．６９邐５．５９邐５．７３邐６１逡逑３邐２８邐２０．７０邐７．４４邐３．７６邐

５邋Ｇ數(shù)據(jù)量）。將測序所得數(shù)據(jù)與人類基函組數(shù)據(jù)庫進行比對，使用Ｔｏｐｈａｔ軟件逡逑分析預測環(huán)狀ＲＮＡ。以上測序及生物信息學分析：￡作由上海晶能生物科技有限逡逑公司完成。測序分析流程圖見下圖（圖２）。逡逑Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑去除ｒＲＮＡ逡逑片段化逡逑隨機打斷片段逡逑隨機引物反轉(zhuǎn)錄逡逑雙鏈ｃＤＮＡ逡逑末端補平、加Ａ，逡逑連接頭逡逑ＰＣＲ擴增逡逑ＲＮＡ－ｓｅｑ邋ｃＤＮＡ文庫逡逑Ｈｉｓｅｑ測序儀測序逡逑圖２．邋ｃｉｒｃＲＮＡ測序建庫流程。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｆｌｏｗ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｃｉｒｃＲＮＡ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．逡逑２．５．３測序結(jié)果驗證逡逑２．５．３．１邋總邋ＲＮＡ邋提取逡逑操作同前。逡逑１８逡逑
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R711.75

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本文編號：2632461