【摘要】：法布雷疾病(Fabry disease;FD),是因GLA基因編碼的α-半乳糖苷酶A缺失或完全喪失而導致的糖鞘脂類底物積累的先天性X連鎖隱性遺傳病。其發(fā)病癥狀隨底物在患者體內積累部位的不同而異。男性患者發(fā)病嚴重,女性多為攜帶者且癥狀較輕。本課題為了進一步研究GLA基因突變導致FD的分子機制,構建了GLA野生型及突變體的細胞模型,并對新發(fā)突變位點進行了致病性研究,同時對突變體的結構及功能做了詳細分析。1.首先對5個FD先證者進行了GLA基因的Sanger測序,確定突變位點分別為:c.119CA、c.101AG、c.680GC、c.801+1G㧐A和c.280T㧐C,分析各個突變的研究進展,發(fā)現(xiàn)c.801+1G㧐A和c.280T㧐C兩個突變位點為新發(fā)突變。因此,本研究主要圍繞GLA基因突變c.801+1G㧐A和c.280T㧐C的致病機制進行研究。2.利用qRT-PCR技術檢測患者血液中GLA基因mRNA的表達量。與正常人相比,患者體內GLA基因的表達量都有所下調且含有c.801+1G㧐A突變的患者下調更多。由于c.801+1G㧐A突變位點位于Intron 5第一位,可能影響前體mRNA的剪接。利用RT-PCR技術檢測患者體內GLA基因的轉錄本。研究表明,患者體內除正常轉錄本外,還存在一個分子量較大的轉錄本,經測序分析,該轉錄本是在Exon 5和Exon6之間插入了36 bp的Intron 5所致;為了進一步闡明剪接異常是否由該突變導致,我們利用minigene技術轉染HEK293T細胞來研究該突變對minigene基因轉錄的影響,結果在mRNA水平和蛋白水平均證明c.801+1G㧐A突變可以引起GLA基因mRNA的異常剪接。3.利用生物信息學、生物化學及細胞生物學的方法對突變體蛋白的結構和功能做進一步研究。通過序列同源性比對發(fā)現(xiàn),這兩個突變位點在不同物種中都高度保守;同源建模分析蛋白質的三級結構發(fā)現(xiàn),c.801+1G㧐A(p.L268IfsX3)突變導致GLA酶活性區(qū)域嚴重受損,部分Domain 1(氨基酸殘基269-330)及全部Domain 2(氨基酸殘基331-429)的結構丟失;c.280 T㧐C(p.C94R)突變緊鄰酶活性位點D92和D93,可能影響該酶與底物的結合,而且突變導致C94與C52形成的二硫鍵斷裂,影響了蛋白質結構的穩(wěn)定性。4.構建GLA-WT及GLA-MT的真核表達載體,通過細胞轉染,免疫熒光技術檢測發(fā)現(xiàn),GLA c.801+1G㧐A突變體蛋白在細胞質內形成聚集體,并且呈斑點狀不均勻分布。另外,與GLA-WT轉染的細胞相比,c.801+1G㧐A突變體可以加速細胞衰老;c.280 T㧐C突變體在細胞內的定位雖無明顯改變,但可導致細胞核發(fā)生皺縮;α-半乳糖苷酶酶活性分析顯示,與GLA-WT相比,這兩個突變體的酶活性均發(fā)生下調,且GLA c.801+1G㧐A突變體的酶活性下降更為顯著。綜上所述,本研究以法布雷患者血液為研究材料,利用Sanger測序技術檢測到兩個GLA基因的兩個新發(fā)突變,應用生物信息學、分子生物學、生物化學及細胞生物學手段找到基因突變引起患者發(fā)病的分子機制,該研究成果將進一步豐富Fabry disease突變數據庫并為FD的臨床精確診斷提供理論依據。
【圖文】：

實驗結果家系 1: 先證者Ⅲ-3 存在突變位點 c.119C>A，患者姐姐Ⅲ-6 及外甥Ⅳ-2 也攜突變位點�；蛲蛔兒�，第 40 位的氨基酸由脯氨酸（P）突變?yōu)榻M氨酸（H位點 P40 位于蛋白質 Domain1 酶活性區(qū)域，位于α螺旋結構末端位置，與氨262 組裝且包埋于三級結構內部。該突變已于 2000 年被報道[33]（HGMD ID003742）Clinver 數據庫對其致病性預測給出一顆星（Variation ID：92539）。TTCTTTGGCCCGCCGCCCCCGCCGGAAGGCTACAAGTGCCTCGCCTCCTCCCAGGAACTTTACGTCCCGCTTTAAGAATGTTTCCTCCTCT CGTCCCGCGACAAAGTTGGTATTGCGCCGCCCCCGCCGTGAATGCCAAACTAACAGGCCCCCGCCCGAGAAAAAGGTGGAC

GLA 新突變的鑒定及其引起法布雷病的機制研究家系 2: 先證者Ⅱ-1 及姐姐Ⅱ-3 的測序結果經比對分析后發(fā)現(xiàn)存在 GLA 基因突變 c.101A> G， 編碼蛋白質的氨基酸第 34 位由天冬酰胺(N)突變?yōu)榻z氨酸(S)，，該突變在 1993 年已被報道（HGMD ID CM930324）。Clinver 數據庫對此位點判斷為致病，預測給出 2 顆星（Variation ID：10724）。N34 包埋在蛋白質三級結構第一個單體 1.7 的位置。氨基酸殘基 N34 與 D224 分別位于氫鍵兩端，對蛋白質三級結構的穩(wěn)定有很大作用。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R596;Q78

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本文編號：2627798