發(fā)布時(shí)間：2020-04-11 03:28

【摘要】：目的:胸腺是人體重要的免疫器官,來自骨髓的淋巴造血祖細(xì)胞在胸腺中與胸腺基質(zhì)細(xì)胞相互作用,進(jìn)而分化、發(fā)育、成熟為T淋巴細(xì)胞。胸腺隨著年齡增長而發(fā)生萎縮,能引起免疫系統(tǒng)衰老和免疫應(yīng)答功能低下,增加了老年人罹患癌癥、自身免疫性疾病以及感染等老年病的風(fēng)險(xiǎn)。而這些嚴(yán)重的老年病可能伴有一種慢性低度炎癥狀態(tài),稱為炎性衰老。炎性衰老被認(rèn)為是免疫衰老的一個(gè)最顯著的后果,但其發(fā)生與胸腺萎縮的直接關(guān)系目前尚不明確。了解胸腺萎縮的分子機(jī)制,以及胸腺萎縮與炎性衰老的關(guān)系,將會為減輕炎性衰老,提高老齡人口健康水平提供理論基礎(chǔ)。研究方法:一、構(gòu)建衰老模型,探索老化鼠是否存在炎性衰老,以及炎性衰老與胸腺萎縮的可能關(guān)系。1、模型構(gòu)建:2月齡C57BL/6雌性小鼠頸背部皮下注射不同劑量D-半乳糖(D-gal),持續(xù)8周,篩選出致胸腺明顯萎縮(與18-20月齡自然老化鼠對比)的劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);2、免疫衰老指標(biāo)測定:流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟CD4~+CD8~-CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(pTreg)水平;3、炎性衰老指標(biāo)測定:流式細(xì)胞術(shù)檢測血液衰老細(xì)胞CD3~+CD8~+CD28~-T細(xì)胞水平,檢測脾臟炎性細(xì)胞CD3~+CD4~+TNF-α~+T細(xì)胞水平;ELISA檢測血清中IL-6水平;HE染色檢測肺的炎性細(xì)胞浸潤情況;4、胸腺自身反應(yīng)性T細(xì)胞前體水平測定:流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟CD4~+CD44~(hi)Ki67~+和CD8~+CD44~(hi)Ki67~+T淋巴細(xì)胞動態(tài)水平;5、胸腺陰性選擇功能評價(jià):流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腺CD4~+CD8~+、CD4~+、CD8~+淋巴細(xì)胞及胸腺Treg(tTreg)細(xì)胞水平;Western blot檢測胸腺Aire蛋白水平。二、探索miRNA-146a-5p在原代胸腺基質(zhì)細(xì)胞成熟前衰老中的可能作用。1、原代胸腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng):取出生3天以內(nèi)的C57BL/6小鼠胸腺,提取并培養(yǎng)胸腺基質(zhì)細(xì)胞;2、探索D-半乳糖致胸腺基質(zhì)細(xì)胞成熟前衰老情況:用不同濃度梯度(0-225mM)D-半乳糖,設(shè)置不同時(shí)間梯度(24h,48,72h)對胸腺基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS)檢測細(xì)胞增殖及活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞活性氧(ROS)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期;衰老相關(guān)(SA)-β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老;Western blot檢測衰老相關(guān)蛋白p16,p21,p53表達(dá)水平,檢測自噬活性相關(guān)蛋白LC3,p62,mTOR水平;3、胸腺基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生成熟前衰老時(shí)miRNA-146a-5p水平測定:Real Time PCR檢測細(xì)胞miRNA-146a-5p水平;4、探索miRNA-146a-5p對胸腺基質(zhì)細(xì)胞成熟前衰老的影響:用lipo RNA~(imax)將miRNA-146a-5p mimic或Negative Control(NC)轉(zhuǎn)染至胸腺基質(zhì)細(xì)胞,Real Time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率;用miRNA-146a-5p mimic和/或D-半乳糖處理胸腺基質(zhì)細(xì)胞,用上述方法檢測細(xì)胞活力,細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期,SA-β半乳糖苷酶水平,檢測衰老相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白水平;5、miRNA-146a-5p對胸腺基質(zhì)細(xì)胞成熟前衰老影響的可能機(jī)制:Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白水平,檢測miRNA-146a靶基因TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)水平。結(jié)果:一、老化鼠存在炎性衰老,且胸腺萎縮能直接加重炎性衰老。1、大劑量的D-半乳糖能誘導(dǎo)小鼠衰老并導(dǎo)致胸腺明顯萎縮,且胸腺萎縮情況及胸腺總細(xì)胞數(shù)的減少與自然老化鼠(18-20月齡)相當(dāng);2、老化鼠出現(xiàn)免疫衰老:pTreg細(xì)胞比例增加;3、老化鼠出現(xiàn)炎性衰老改變:外周衰老細(xì)胞(CD3~+CD8~+CD28~-T細(xì)胞)比例增加,外周CD3~+CD4~+TNF-α~+炎性T淋巴細(xì)胞比例增加,血液IL-6水平增加,肺部炎性細(xì)胞浸潤;4、老化鼠的自身反應(yīng)性T細(xì)胞前體(CD4~+CD44~(hi)Ki67~+和CD8~+CD44~(hi)Ki67~+T細(xì)胞)比例增加;5、老化鼠胸腺陰性選擇功能受損:胸腺CD4CD8雙陽性淋巴細(xì)胞比例減少、CD4、CD8單陽性淋巴細(xì)胞比例增加,胸腺tTreg細(xì)胞比例增加;6、老化鼠胸腺Aire蛋白表達(dá)降低;二、miR-146a-5p能緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的原代胸腺基質(zhì)細(xì)胞成熟前衰老。1、225mM的D-半乳糖處理48小時(shí)能使胸腺基質(zhì)細(xì)胞活力明顯下降;2、225mM的D-半乳糖處理48小時(shí)能使胸腺基質(zhì)細(xì)胞ROS明顯增加;3、D-半乳糖能誘導(dǎo)原代胸腺基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生成熟前衰老:0-225mM的D-半乳糖處理胸腺基質(zhì)細(xì)胞48小時(shí),細(xì)胞凋亡未發(fā)生明顯變化,但能使胸腺基質(zhì)細(xì)胞周期阻滯在G2期,能使SA-β-半乳糖苷酶水平逐漸增加,能使細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p53,p16,p21逐漸增加,能使自噬活性相關(guān)蛋白LC3II/LC3I降低,p62蛋白增加,mTOR蛋白水平增加;4、胸腺基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生成熟前衰老時(shí),miRNA-146-5p減少;5、過表達(dá)miRNA-146a-5p能減輕胸腺基質(zhì)細(xì)胞的成熟前衰老:過表達(dá)miRNA-146a-5p能逆轉(zhuǎn)胸腺基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生成熟前衰老時(shí)的細(xì)胞活力降低;能使細(xì)胞周期阻滯緩解;能降低SA-半乳糖苷酶水平;能降低衰老相關(guān)蛋白水平;6、miRNA-146a-5p不能逆轉(zhuǎn)胸腺基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生成熟前衰老時(shí)的自噬活性降低;7、miRNA-146a-5p能逆轉(zhuǎn)胸腺基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生成熟前衰老時(shí)的TRAF6的升高。結(jié)論:1、老化鼠存在炎性衰老狀態(tài);2、胸腺萎縮后,陰性選擇受損,外周自身反應(yīng)性T細(xì)胞前體增加,可直接加重炎性衰老;3、胸腺基質(zhì)細(xì)胞對ROS刺激較敏感,隨著ROS增加會出現(xiàn)成熟前衰老;4、過表達(dá)miR-146a-5p能減輕胸腺基質(zhì)細(xì)胞的成熟前衰老;5、miRNA-146a-5p可能對延緩胸腺萎縮有作用,從而減輕炎性衰老。
【圖文】：

-半乳糖能誘導(dǎo)C57/BL6小鼠衰老和胸腺萎縮分別用不同劑量的D-半乳糖連續(xù)頸背部皮下注射60天后，D-半乳糖組(200，500，1000mg/kg/d)、青年對照組(4mo-old)、媒介對照組(NS)和自然老化(18-20mo-old，Aged)小鼠(A)血清MDA含量；(B)血清SOD活性；(C)胸腺大體圖像；(D)胸腺指數(shù)（胸腺重量/10g體重）；(E)胸腺總細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)

圖 2. D-半乳糖誘導(dǎo) C57/BL6 小鼠出現(xiàn)免疫衰老分別用不同劑量的 D-半乳糖連續(xù)頸背部皮下注射 60 天后，(A)流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟pTreg 細(xì)胞在脾臟 CD4 陽性細(xì)胞群中比例；(B) pTreg 細(xì)胞在脾臟 CD4 陽性 T 淋巴細(xì)胞中所占的比例統(tǒng)計(jì)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Con and NS。3.3 老化鼠出現(xiàn)炎性衰老改變接下來，為了明確老化鼠是否存在炎性衰老狀態(tài)，我們對老化鼠（自然老化鼠與 D-半乳糖快速老化鼠）的炎性衰老指標(biāo)進(jìn)行檢測。如圖 3A 和 3B 所示，與“年輕”對照及 NS 組相比，500 及 1000mg/kg/d 的 D-半乳糖能提高小鼠血液中衰老細(xì)胞（CD3+CD8+CD28-T 淋巴細(xì)胞）在 CD3 陽性 T 細(xì)胞群的比例，其中 1000mg/kg/d 引起的提高與自然老化鼠相似。除此之外，老化鼠的外周（脾臟）炎性 T 細(xì)胞（CD3+CD4+TNF-α+細(xì)胞）在脾臟 CD4 陽性細(xì)胞群中的比例增加（圖 3C 和 3D）。炎性衰老的主要改變還包括血清 IL-6 水平的變化，因此我們對血清 IL-6 進(jìn)行檢測，，
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R583

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本文編號：2623090