【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕為主要特征的自身免疫性疾病。RA中的自身免疫可能首先在粘膜部位響應(yīng)環(huán)境損傷而觸發(fā),但是需要特異性靶向關(guān)節(jié)以引發(fā)疾病。而破骨細(xì)胞在引發(fā)關(guān)節(jié)自身免疫中具有重要作用。破骨細(xì)胞主要由NF-κB配體受體激活劑(RANKL)驅(qū)動(dòng)骨髓前體細(xì)胞分化而來(lái),可直接介導(dǎo)骨吸收導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷。因此,調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和作用是治療RA的有效策略。C反應(yīng)蛋白(CRP)是RA的確定性標(biāo)志物,其血液表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度和進(jìn)展密切相關(guān)。但由于CRP如何在RA潛在的病理過(guò)程中發(fā)揮作用仍未完全揭示,因此,我們通過(guò)解釋CRP的構(gòu)象和RANKL依賴性行為來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。CRP由五個(gè)相同的亞基組成,但在進(jìn)入局部病變時(shí)解離成單體構(gòu)象,即mCRP。事實(shí)上,已確定mCRP是RA患者滑膜組織中存在的主要構(gòu)象。我們通過(guò)檢測(cè)不同構(gòu)像CRP在破骨細(xì)胞分化中的作用,確定CRP在病理過(guò)程中發(fā)揮作用的方式和途徑。我們首先使用Raw 264.7巨噬細(xì)胞系和小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞(BMDM)驗(yàn)證了CRP的構(gòu)象依賴性作用。天然CRP(nCRP)與巨噬細(xì)胞僅具有較弱結(jié)合并且不能驅(qū)動(dòng)破骨細(xì)胞分化;而mCRP與巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)烈結(jié)合并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成基因TRAP的高表達(dá),導(dǎo)致形成具有骨吸收活性的多核破骨細(xì)胞。由于實(shí)驗(yàn)體系中加入多粘菌素B,因此mCRP的破骨分化作用不是由于殘留內(nèi)毒素的污染引起的。此外,煮沸蛋白或刪除關(guān)鍵識(shí)別基序,即與脂筏相互作用的膽固醇結(jié)合序列(CBS;aa 35-47),均可以降低并減弱mCRP的作用。另外,與體外結(jié)果一致,在健康小鼠的顱蓋上皮下注射mCRP可以導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)目增加和明顯的骨小梁損傷。因此,我們得出結(jié)論CRP誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化取決于單體構(gòu)象。我們通過(guò)利用基因表達(dá)譜分析,在mCRP處理BMDM巨噬細(xì)胞后破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因響應(yīng)于mCRP而差異表達(dá),但經(jīng)典RNAKL通路幾乎不參與介導(dǎo)mCRP的下游效應(yīng)。另外分析了由mCRP和RANKL誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜之間的差異,并且通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑篩選證明它們激活不同的途徑。mCRP主要通過(guò)NF-κB和磷脂酶C起作用,而RANKL信號(hào)傳導(dǎo)涉及更廣泛的網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明通過(guò)mCRP誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化不依賴于RANKL。由于mCRP似乎與RANKL的作用不同,我們探究這兩種誘導(dǎo)劑是否在破骨細(xì)胞分化中具有協(xié)同作用。當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用時(shí),RANKL比mCRP在單獨(dú)誘導(dǎo)BMDMs中破骨細(xì)胞生成基因表達(dá)時(shí)的效力高3至10倍。然而,當(dāng)與mCRP一起使用時(shí),RANKL的作用完全消失,其凈反應(yīng)與單獨(dú)作用的mCRP相當(dāng)。在TRAP染色和骨吸收測(cè)定中也獲得了類似的發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明,mCRP可能抑制RANKL對(duì)破骨細(xì)胞分化的活性。mCRP在發(fā)炎組織中特異性轉(zhuǎn)換,因此,mCRP的作用僅限于病理性破骨細(xì)胞分化,其中過(guò)度表達(dá)的RANKL也起到主要作用。在這種情況下mCRP的總體效應(yīng)可能由于RANKL而受抑制。與此推測(cè)一致,CRP敲除小鼠(CRP KO)的骨吸收表型與正常顱蓋中的野生型小鼠的骨吸收表型是相同的,但在皮下注射LPS后表現(xiàn)出破骨細(xì)胞數(shù)量增加以及骨小梁損傷的增強(qiáng)。mCRP對(duì)RANKL的抑制可能是由于它們引起的信號(hào)通路之間的干擾。然而,在小鼠BMDM和外周血單核細(xì)胞(PBMC)中觀察到mCRP完全和持續(xù)抑制RANKL,使得這種可能性不大可能。相反,由于它們直接的物理相互作用而產(chǎn)生的抑制似乎更具有可能性。通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mCRP以高親和力結(jié)合RANKL,同時(shí)刪除mCRP的主要識(shí)別基序CBS或者合成CBS肽段進(jìn)行結(jié)合競(jìng)爭(zhēng),均可有效抑制mCRP與RANKL的結(jié)合。此外,CBS肽段在破骨細(xì)胞數(shù)目和破骨損傷面積水平上,可有效抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。因此,mCRP和RANKL之間的物理相互作用由CBS介導(dǎo)。
【圖文】：

蘭州大學(xué)博士研究生學(xué)位論文 單體 C 反應(yīng)蛋白調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究能單獨(dú)作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞。而 RANKL 是唯一能夠直接作用并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞前體及成熟破骨細(xì)胞的細(xì)胞因子[12]。骨保護(hù)素（Osteoprotegerin，OPG）作為 RANK 受體可以與 RANKL 因子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，所以 OPG 也能夠有效調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能，在維持骨代謝平衡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13-15]。

成熟的多核破骨細(xì)胞被多種信號(hào)通路激活，從而導(dǎo)致骨重建的開(kāi)始（細(xì)胞的細(xì)胞體是極化的，并且通過(guò) RANKL[33]響應(yīng)于 RANK 的激活細(xì)胞激活后會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，使其準(zhǔn)備好吸收骨基質(zhì)。首先具有可改變的細(xì)骨架系統(tǒng)在骨表面移動(dòng)，比如肌動(dòng)蛋白的重排和骨表間通過(guò)緊密連接以形成密封隔室，，然后破骨細(xì)胞細(xì)胞膜褶皺可通過(guò)物產(chǎn)生氫離子向外輸出[34]，酸化外部的密封隔室，使其 pH 降低到 4基質(zhì)中的無(wú)機(jī)質(zhì)溶解[35,36]。此外，破骨細(xì)胞中豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高通過(guò)持續(xù)分泌溶解酶 TRAP 和前體-CATK 進(jìn)入吸收坑（Howship's la細(xì)胞得以侵蝕下面的骨骼。同時(shí)在酸性條件下，CTSK 與 MMP-9 也有機(jī)基質(zhì)膠原的降解[38-40]。所有降解產(chǎn)物（膠原片段與溶解的鈣和磷骨細(xì)胞內(nèi)被處理并通過(guò)胞吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)[41]釋放到循環(huán)中。體外實(shí)驗(yàn)中 以劑量依賴性方式激活成熟的破骨細(xì)胞，并且在體內(nèi)可以通過(guò)激活破導(dǎo)致骨吸收[42]。成熟破骨細(xì)胞的存活及其參與連續(xù)幾輪骨吸收，部分胞因子調(diào)節(jié)[43]。RANKL 和白細(xì)胞介素（IL）-1 在體外和體內(nèi)可有效骨細(xì)胞的存活時(shí)間，這可能是由于這些因子可誘導(dǎo)提升 NF-κB 的活
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R593.22

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本文編號(hào)：2619424