【摘要】：研究目的動物及流行病學(xué)的研究都發(fā)現(xiàn),肥胖癥不僅會危害外周組織器官的生理功能,還能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS),危害腦健康,引起認(rèn)知功能障礙。高脂飲食及肥胖時首先會導(dǎo)致外周及中樞系統(tǒng)糖脂代謝紊亂,影響CNS的信號傳導(dǎo),引起神經(jīng)元凋亡,損害腦組織結(jié)構(gòu)和功能,降低認(rèn)知功能,并增加患癡呆等神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險。因此,肥胖是誘發(fā)大腦疾病的重要風(fēng)險因素。但目前對肥胖引起認(rèn)知功能下降的原因仍未能全面了解,尤其是與認(rèn)知功能關(guān)系最為密切的前額葉的影響仍缺乏相關(guān)研究。本研究通過觀察高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠前額葉內(nèi)NMDAR1、N-AChR、SYN38、BDNF神經(jīng)可塑相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,以及肥胖大鼠的前額葉內(nèi)是否發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡以及相關(guān)信號通路變化,分析ERS、自噬及細(xì)胞凋亡是否為肥胖時神經(jīng)可塑相關(guān)蛋白表達(dá)下降的主要機制。進(jìn)而評價前額葉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬在肥胖影響認(rèn)知功能中的作用和機制。通過觀察肥胖大鼠中等強度有氧運動后對上述現(xiàn)象的逆轉(zhuǎn)效果。研究中等強度有氧運動對前額葉ERS、自噬和凋亡以及相關(guān)信號通路是否有改善作用,并探討PPARγ在有氧運動增加NMDAR1、N-AChR、SYN38、BDNF的表達(dá)是否與改善前額葉ERS有關(guān)。研究方法研究一:使用7周齡雄性SD大鼠150只,普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,根據(jù)體重隨機分為兩組:(1)普通飼料組(NCD組,n=40),普通飼料喂養(yǎng);(2)高脂飼料組(HFD組,n=110),高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8周后,以高脂飼料組大鼠體重大于等于普通飼料組大鼠平均體重加1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差為標(biāo)準(zhǔn)來篩選高脂膳食誘導(dǎo)肥胖大鼠(DIO),建立肥胖大鼠模型。第9周初,將普通飼料組大鼠和肥胖組大鼠根據(jù)體重隨機挑選出一定數(shù)量的大鼠并分為四組:普通飼料安靜對照組(CS組,n=12)、普通飼料運動組(CE組,n=12),肥胖安靜組(OS組,n=12),肥胖運動組(OE組,n=12)。運動組大鼠進(jìn)行為期8周的有氧運動。實驗第17周末,各組大鼠禁食12h過夜,經(jīng)麻醉處死后,下腔靜脈取血5ml/只,并剝離大鼠前額葉組織,用蛋白抽提試劑盒抽提前額葉的膜蛋白、胞質(zhì)蛋白和核蛋白。使用分光光度計檢測大鼠血清中的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量,使用Western Blot檢測大鼠前額葉內(nèi)如下蛋白的表達(dá)水平:脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白FATP1,ERS通路蛋白GRP78、p-PERK/PERK、p-IRE1α/IRE1α、p-eIF2α/eIF2α和ATF4,ERS介導(dǎo)凋亡發(fā)生的標(biāo)志蛋白caspase-12、CHOP和p-JNK,反應(yīng)抗凋亡能力的蛋白Bcl-2/Bax,自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1、LC3Ⅰ/Ⅱ,神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白NMDAR1、BDNF、SYN和AchR,以及PPARγ信號通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB及caspase9等。研究二:SPF級新生SD大鼠(出生24h以內(nèi)),雌雄不限,分離出新生鼠前額葉細(xì)胞并培養(yǎng)6天。使用棕櫚酸配制高脂培養(yǎng)基、并分別添加ERS抑制劑(4-PBA)、自噬抑制劑(3-MA)和PPARγ激動劑(羅格列酮),繼續(xù)培養(yǎng)前額葉細(xì)胞24h,通過觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,確定不同培養(yǎng)基的最佳使用濃度。之后實驗分為五組:(1)正常對照組(C組):Neurobasal無血清培養(yǎng)基;(2)高脂組(PA組):添加0.5 mM棕櫚酸的Neurobasal培養(yǎng)基;(3)ERS抑制劑組(4-PBA組):在0.5mM棕櫚酸的Neurobasal培養(yǎng)基中加入5 mM的4-PBA;(4)自噬抑制劑組(3-MA組):在0.5 mM棕櫚酸的Neurobasal培養(yǎng)基中加入2.5 mM的3-MA。(5)PPARγ激動劑組(Rosi組):在0.5 mM棕櫚酸的Neurobasal培養(yǎng)基中加入40μm的Rosi。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h,收集細(xì)胞,用Western Blot檢測前額葉細(xì)胞內(nèi)研究一中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。研究結(jié)果研究一:1.高脂飼料組大鼠經(jīng)8周高脂膳食后,其體重顯著高于普通飼料組大鼠(p0.01),符合肥胖標(biāo)準(zhǔn)的大鼠有63只,肥胖建模成功率為57.27%(63/110)。與普通飼料組大鼠相比,肥胖大鼠血清中TG、TC和LDL-C的濃度顯著升高(p0.01),HDL-C濃度顯著降低(p0.01)。2.經(jīng)8周有氧運動干預(yù)后,OE組大鼠的攝食量、體重均顯著低于OS組大鼠(p0.01),血清中的TG、TC和LDL-C的濃度濃度也顯著降低(p0.01),HDL-C濃度顯著升高(p0.01)。3.FATP1(F(1,20)=43.14,p0.01)的蛋白表達(dá)水平有顯著的交互效應(yīng)。Post-hoc結(jié)果表明,OS組大鼠FATP1含量顯著性高于CS組(p0.01)。8周有氧運動干預(yù)后,OE組大鼠前額葉內(nèi)FATP1含量顯著性低于OS組(p0.01)。4.與CS組比較,OS組GRP78表達(dá)、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值顯著升高(p0.01);與OS組相比,OE組GRP78表達(dá)、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α(p0.01)比值顯著下降(p0.01);OE與CS相比,p-eIF2α/eIF2α比值顯著升高(p0.05),GRP78、p-PERK/PERK指標(biāo)無顯著差異。統(tǒng)計結(jié)果顯示,p-IRE1α/IRE1α(F(1,20)=22.60,p0.01)、ATF4(F(1,20)=4.582,p0.05)有顯著的飲食主效應(yīng),ATF4(F(1,20)=69.47,p0.01)有顯著的運動主效應(yīng),但均無交互效應(yīng)。5.Beclin-1(F(1,20)=15.38,p0.01)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(F(1,20)=7.999,p0.05)均有顯著的飲食主效應(yīng),但均無運動主效應(yīng),也無交互效應(yīng)。6.與CS組比較,OS組caspase12、CHOP的表達(dá)和Bax/Bcl-2比值顯著升高(p0.01);與OS組相比,OE組caspase12和CHOP表達(dá)及Bax/Bcl-2比值顯著降低(p0.01);OE與CS相比,CHOP(p0.01)及Bax/Bcl-2(p0.05)表達(dá)水平顯著升高。統(tǒng)計結(jié)果顯示,p-JNK(F(1,20)=21.69,p0.01)有顯著的飲食主效應(yīng),但沒有顯著的運動主效應(yīng)和交互作用。7.與CS組比較,OS組BDNF和SY38表達(dá)水平顯著降低(p0.01);與OS組相比,OE組BDNF和SY38表達(dá)無顯著性差異;OE與CS相比,BDNF和SY38表達(dá)也無顯著性差異。然而,AChR(飲食主效應(yīng)F(1,20)=21.99,p0.01,運動主效應(yīng)F(1,20)=13.69,p0.01)均有飲食和運動主效應(yīng),但無顯著交互效應(yīng)。8.PPARγ(飲食主效應(yīng)F(1,20)=44.12,p0.01,運動主效應(yīng)F(1,20)=11.99,p0.01)均有飲食和運動主效應(yīng),但無顯著交互效應(yīng)。p-PI3K/PI3K(飲食主效應(yīng)F(1,20)=15.23,p0.01,運動主效應(yīng)F(1,20)=15.47,p0.01)均有飲食和運動主效應(yīng),但無顯著交互效應(yīng)。與CS組比較,OS組p-Akt/Akt(p0.01)表達(dá)水平顯著降低;與OS組相比,OE組p-Akt/Akt(p0.05)表達(dá)顯著升高,OE組與CS相比,p-Akt/Akt表達(dá)無差異;caspase9(飲食主效應(yīng)F(1,20)=10.63,p0.01,運動主效應(yīng)F(1,20)=6.208,p0.05)和p-CREB/CREB(飲食主效應(yīng)F(1,20)=154.8,p0.01,運動主效應(yīng)F(1,20)=233.9,p0.05)均有飲食和運動主效應(yīng),但caspase9和p-CREB/CREB表達(dá)均無顯著交互效應(yīng)。研究二:1.在培養(yǎng)的前額葉細(xì)胞中加入不同濃度PA處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn),0.5m M PA可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生,且細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴的效應(yīng)曲線。對培養(yǎng)的前額葉細(xì)胞進(jìn)行不同干預(yù)發(fā)現(xiàn),PA組細(xì)胞凋亡率(19.53±1.35)顯著高于C組(1.47±0.32,p0.01);與PA組相比較,5m M 4-PBA組(6.0±0.39)、20μM Rosi組(11.8±0.97)和40μM Rosi組(6.56±0.33)細(xì)胞凋亡率顯著降低(p0.01),而2.5m M 3-MA組(47.6±1.25)、5m M 3-MA組(60.5±4.25)和10m M 4-PBA組(45.3±2.57)則顯著升高(p0.01)。2.與C組相比,PA組(p0.05)的FATP1表達(dá)均顯著升高,與PA組相比,4-PBA、3-MA、Rosi各組的FATP1表達(dá)無差異。3.與C組相比,PA組GRP78(p0.05)、p-IRE1α/IRE1α、p-PERK/PERK、p-e IF2α/e IF2α、、ATF4、P-JNK、CHOP和caspase12表達(dá)顯著升高(p0.01);與PA組比較,4-PBA組GRP78(p0.05)、p-IRE1α/IRE1α(p0.01)、p-PERK/PERK(p0.05)、p-e IF2α/e IF2α(p0.01)和ATF4(p0.01)、P-JNK(p0.01)、CHOP(p0.01)和caspase12(p0.01)表達(dá)顯著降低;3-MA組GRP78(p0.05)、p-PERK/PERK(p0.05)和CHOP(p0.01)顯著升高,p-IRE1α/IRE1α比值顯著降低(p0.01);Rosi組GRP78(p0.05)、p-IRE1α/IRE1α(p0.01)、ATF4(p0.05)、P-JNK(p0.05)、CHOP(p0.05)和caspase12(p0.01)的水平顯著降低。4.與C組相比,PA組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著升高(p0.01),與PA組相比,4-PBA組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著降低(p0.01);3-MA組Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)顯著降低(p0.01),而Rosi組自噬指標(biāo)無顯著差異。5.與C組相比,PA組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-CREB/CREB比值顯著降低(p0.01),Bax/Bcl-2和caspase9顯著升高(p0.01);與PA組相比較,4-PBA組的p-CREB/CREB比值顯著升高(p0.05),3-MA組PPARγ(p0.01)、p-PI3K/PI3K(p0.05)、p-Akt/Akt比值(p0.01)均顯著降低,caspase9顯著升高(p0.01);Rosi組PPARγ、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-CREB/CREB比值均顯著升高(p0.01),Bax/Bcl-2比值、caspase9的表達(dá)均顯著降低(p0.01)。6.與C組相比,PA組NMDAR1、SYN、BDNF和ACh R的表達(dá)均顯著降低(p0.01),與PA組相比,4-PBA組SYN(p0.05)、BDNF(p0.01)的表達(dá)顯著升高;3-MA組各蛋白表達(dá)無顯著差異;Rosi組SYN(p0.05)、BDNF(p0.01)和ACh R(p0.05)的表達(dá)均顯著升高。結(jié)論:1.在體研究表明,高脂膳食能誘導(dǎo)SD大鼠肥胖,并導(dǎo)致血脂異常,并促進(jìn)肥胖大鼠前額葉FATP1的蛋白表達(dá),將轉(zhuǎn)運過多的脂肪酸進(jìn)入腦細(xì)胞,誘發(fā)大鼠前額葉ERS,使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工合成蛋白質(zhì)的功能減弱,持續(xù)的ERS引起細(xì)胞凋亡發(fā)生,在體和離體研究均表明,前額葉細(xì)胞發(fā)生ERS時會抑制PPARγ、p-PI3K、p-Akt及p-CREB等蛋白表達(dá),這些因素共同作用最終降低了肥胖大鼠前額葉內(nèi)神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)。2.有氧運動干預(yù)能改善肥胖大鼠的血脂異常,降低前額葉內(nèi)FATP1的蛋白表達(dá),緩解前額葉ERS,降低細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),通過激活PPARγ信號通路促進(jìn)PI3K、Akt及CREB等蛋白活化,最終增加SYN、BDNF和ACh R等神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)。3.離體研究表明,棕櫚酸誘導(dǎo)的前額葉ERS會伴隨自噬水平增加,自噬的激活對ERS及其介導(dǎo)細(xì)胞凋亡起到抑制的作用。使用激活劑激活PPARγ及其介導(dǎo)的信號通路,可緩解ERS及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生,PPARγ的激活對細(xì)胞具有保護作用,抑制ERS和激活PPARγ信號通路可促進(jìn)SYN、BDNF和ACh R等神經(jīng)可塑相關(guān)蛋白的表達(dá)。
【圖文】：

肥胖大鼠前額葉神經(jīng)可塑性蛋白表達(dá)下降與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 -自噬的關(guān)系及運動的調(diào)節(jié)作用BDNF 的表達(dá)是否與改善前額葉 ERS 及 PPARγ 通路活化有關(guān)。這些問題的解決既可以進(jìn)一步揭示肥胖致大鼠前額葉損傷的分子機制，又可以揭示運動改善肥胖所致大鼠前額葉損傷的分子機制，，有利于深入認(rèn)識肥胖、腦健康和運動的關(guān)系。

在體研究技術(shù)路線圖
【學(xué)位授予單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R589.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 任增輝;大強度遞增負(fù)荷運動對大鼠海馬細(xì)胞凋亡PI3K/AKT信號通路的影響[D];山東體育學(xué)院;2015年

本文編號：2612093