【摘要】：目的:通過構(gòu)建梯度脫礦的松質(zhì)骨體系來研究不同礦化程度的松質(zhì)骨(CBM)對骨髓來源的間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化的影響及對骨缺損修復(fù)過程的作用。方法:利用打孔器從豬肩胛骨中獲取圓柱狀松質(zhì)骨,利用1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)及1%十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液對松質(zhì)骨進行脫細胞處理后,使用乙二胺四乙酸鐵鈉(EDTA-2Na)溶液配合超聲,對松質(zhì)骨分別進行0,4,8,12小時脫鈣處理。對松質(zhì)骨鈣磷含量分布、力學(xué)性質(zhì)、細胞毒性等進行分析后,將鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)種植于不同礦化程度松質(zhì)骨中,觀察細胞在松質(zhì)骨材料上的黏附、伸展、增殖情況,且在細胞種植后1,2,4周,利用定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及免疫熒光染色對細胞內(nèi)成骨相關(guān)基因表達含量進行分析,包括Ⅰ型膠原蛋白(Col-1α),堿性磷酸酶(ALP),骨形成蛋白(BMP-2)等。將20只新西蘭兔備皮暴露兩側(cè)股骨下端,于內(nèi)外髁分別制造直徑約4毫米的骨缺損,填充入脫礦0,4,8,12小時的松質(zhì)骨材料,術(shù)后定期評估實驗兔術(shù)區(qū)恢復(fù)情況及后肢運動能力。材料植入6,8周后,將實驗兔安樂死并獲取股骨下段,運用MicroCT掃描、組織學(xué)染色等手段進行標(biāo)本分析,了解各組別中骨缺損修復(fù)程度、血管生成情況等,綜合評估不同礦化程度松質(zhì)骨材料對骨修復(fù)影響。結(jié)果:1.松質(zhì)骨在超聲結(jié)合EDTA-2Na溶液條件下可獲得較穩(wěn)定且有效的脫礦效果,鈣離子濃度隨脫礦時間延長而逐漸降低,在12小時后松質(zhì)骨可實現(xiàn)完全脫礦(p0.01)。2.松質(zhì)骨礦化程度下降會造成鈣磷含量下降(p0.05)及分布松散,原子力顯微鏡分析提示材料彈性模量、黏附力下降,而材料孔隙率相應(yīng)升高(p0.01),且BMP-2蛋白暴露增多。3.部分脫礦化松質(zhì)骨(脫礦4,8小時)的細胞黏附和伸展能力較未脫礦骨無顯著性下降,而完全脫礦骨內(nèi)細胞黏附能力降低。4.間充質(zhì)干細胞在部分脫礦化松質(zhì)骨中表達成骨相關(guān)蛋白能力(包括Col-1α,ALP,BMP-2等蛋白)高于未脫礦及完全脫礦松質(zhì)骨材料(p0.05)。5.部分脫礦松質(zhì)骨在促進新生骨小梁及新生血管形成及生長的促進作用優(yōu)于未脫礦及完全脫礦松質(zhì)骨材料。結(jié)論:利用EDTA-2Na溶液及超聲聯(lián)合脫礦方法可以獲得穩(wěn)定的梯度脫礦松質(zhì)骨體系,且部分脫礦骨在促細胞黏附、增殖、分化及骨缺損修復(fù)過程中表現(xiàn)優(yōu)于未脫礦骨及完全脫礦骨,其機制可能與鈣離子濃度調(diào)節(jié)BMP-2蛋白表達相關(guān)。
【圖文】：

圖４．１邋ＣＢＭ材料經(jīng)脫細胞脫礦處理后成分變化。Ａ：脫細胞前后大體圖；Ｂ：逡逑脫細胞前后ＤＮＡ含量變化；Ｃ：脫礦前后大體圖；Ｄ：脫礦前后鈣濃度變化；Ｅ：逡逑ＥＤＳ圖顯示梯度脫礦后ＤＣＢＭ材料中碳、鈣、磷元素分布變化圖。逡逑注：圖Ａ比例尺為３ｍｍ。圖Ｃ比例尺為３ｍｍ。檢測結(jié)果以平均值士方差呈現(xiàn)，逡逑

正文結(jié)果逡逑利用邋ｍｉｃｒｏ－ＣＴ邋掃描測量孔隙大小分別為邋２２７．２士４６．９，邋３８５．６±３０．４，邋４０２．６±７２．４，逡逑６１９±８１．３ｐｍ邋（圖２Ａ－Ｂ），這提示ＤＣＢＭ的孔隙大小隨著脫礦時間延長逐漸增大。逡逑Ｍａｓｓｏｎ三色染色用于觀察ＤＣＢＭ材料表面的膠原纖維排布。在骨組織中，大部分逡逑膠原纖維為一型。如補充圖２Ｃ所示，，Ｍａｓｓｏｎ三色染色中成熟的礦化組織被染成逡逑紅色而不成熟的礦化組織及膠原纖維被染成藍色。未脫礦的ＤＣＢＭ中膠原纖維被逡逑礦化組織覆蓋。然而，當(dāng)脫礦時間增加后，骨組織內(nèi)可以觀察到更多藍染的區(qū)域，逡逑提示不成熟礦化組織及膠原纖維暴露增加。逡逑ｐｍ邐邐邐逡逑Ａ邋0Ｈ邐４Ｈ邐８Ｈ邐１２Ｈ邋Ｂ邋８00——－＿ｉｉｉ邋邋—逡逑．５邐－１逡逑ｑ邐ＯＨ邋４Ｈ邋８Ｈ邋１２Ｈ逡逑丫邋：逡逑圖２邋ＤＣＢＭ材料ｍｉｃｒｏ－ＣＴ孔隙分析及Ｍａｓｓｏｎ染色。Ａ：不同礦化水平逡逑ＤＣＢＭ的Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ掃描圖；Ｂ：根據(jù)Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ掃描結(jié)果測得各組ＤＣＢＭ孔隙大逡逑小；Ｃ：不同礦化水平ＤＣＢＭ的Ｍａｓｓｏｎ染色。逡逑注：圖Ａ比例尺為２ｍｍ。圖Ｃ比例尺為５０ｐｍ。檢測結(jié)果以平均值±方差呈逡逑現(xiàn)，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１。逡逑４．１．２原子力纖維鏡下材料的超微結(jié)構(gòu)分析逡逑為了更加了解脫礦后ＤＣＢＭ材料的變化，我們利用原子力纖維鏡來評估不同逡逑礦化程度的ＤＣＢＭ的超微力學(xué)性質(zhì)。在鋒利差掃描圖（圖３Ａ），膠原纖維被覆蓋逡逑在無機組織下，在脫礦過程中，膠原纖維更多暴露于材料表面，因此提供更多精逡逑氨酸－甘氨酸－天冬氨酸配體供細胞結(jié)合黏附。在完全脫礦的ＤＣＢＭ中
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Georgios I Drosos;Panagiotis Touzopoulos;Athanasios Ververidis;Konstantinos Tilkeridis;Konstantinos Kazakos;;Use of demineralized bone matrix in the extremities[J];World Journal of Orthopedics;2015年02期

本文編號：2604009