發(fā)布時(shí)間：2020-03-26 16:12

【摘要】：目的:支氣管哮喘(Bronchial asthma)是由氣道炎癥細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)、結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如氣道上皮細(xì)胞)和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。當(dāng)過敏原進(jìn)入氣道后,即被抗原呈遞細(xì)胞捕獲,呈遞給CD4+T細(xì)胞�？乖蔬f的最重要條件是在呈遞部位有IL-4以及某些決定T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞的輔助受體的參與。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-3和IL-5等細(xì)胞因子,其中IL-4和IL-3誘導(dǎo)漿細(xì)胞產(chǎn)生IgE,通過高親和性受體FcεRⅠ結(jié)合到肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上。當(dāng)相應(yīng)抗原與IgE結(jié)合時(shí),會(huì)產(chǎn)生一個(gè)激動(dòng)信號(hào)使細(xì)胞(主要是肥大細(xì)胞)活化,導(dǎo)致各種化學(xué)介質(zhì)的釋放。組胺和LTs等生化介質(zhì)可引起局部組織效應(yīng),包括氣道平滑肌收縮、組織水腫、黏液分泌增加和神經(jīng)刺激癥狀等,最終導(dǎo)致搔癢和打噴嚏。IL-18是IL-1家族中一種多效促炎性細(xì)胞因子,在固有免疫和適應(yīng)性免疫中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)IL-18變異與哮喘嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。IL-18和IL-18R在致命性哮喘患者肺內(nèi)強(qiáng)烈表達(dá),提示IL-18在哮喘中起作用。另一方面,哮喘尤其是難治性哮喘患者的痰液上清液中IL-18水平明顯低于正常人,這種變化與巨噬細(xì)胞的數(shù)目成正比,與中性粒細(xì)胞的百分比成反比,與嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)和嗜酸性粒細(xì)胞不相關(guān)。為了進(jìn)一步了解IL-18在哮喘中的潛在作用,在本研究中我們檢測(cè)了血液嗜堿性粒細(xì)胞和痰液肥大細(xì)胞中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),鏈格孢提取物誘導(dǎo)培養(yǎng)后,正常人支氣管上皮細(xì)胞迅速釋放IL-18并通過NF-κB依賴途徑直接啟動(dòng)幼稚CD4+T細(xì)胞的Th2極化。還有研究發(fā)現(xiàn)IL-18與肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞分泌IL-13相關(guān),提示過敏原可能通過IL-18引起過敏性氣道反應(yīng),而IL-18能夠影響肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的功能。由于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞是哮喘中的關(guān)鍵細(xì)胞類型,它們可以產(chǎn)生一系列不同的細(xì)胞因子,因此它們可能是IL-18的主要來源。通過研究IL-18、IL-18BP和IL-18R的相關(guān)機(jī)制,我們研究了肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞在哮喘中的潛在作用,并進(jìn)一步探究了IL-18相關(guān)機(jī)制在哮喘發(fā)病中的作用。由于嗜堿性粒細(xì)胞的數(shù)目極少,我們將通過樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)進(jìn)一步研究IL-18等細(xì)胞因子分泌的機(jī)制。DCs是哮喘發(fā)病的始動(dòng)者,能夠驅(qū)使CD4+幼稚型T細(xì)胞活化并向Th2細(xì)胞分化,在維持免疫反應(yīng)和免疫耐受方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用。DCs細(xì)胞監(jiān)視環(huán)境的受體有多種,包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)。LPS是TLR4受體激動(dòng)劑,同時(shí)也是實(shí)驗(yàn)和臨床上的高效佐劑之一。TLR4受體不同于其他的TLR受體,它的下游信號(hào)可以通過兩個(gè)獨(dú)立的通路傳導(dǎo)。第一個(gè)通路依賴于MyD88轉(zhuǎn)接蛋白。MyD88信號(hào)通路在促炎性因子(如IL-6和TNF-α)釋放中有非常重要的作用,但研究發(fā)現(xiàn)共刺激分子的上調(diào)是不需要MyD88信號(hào)通路的,由此發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)通路MyD88非依賴性信號(hào)通路,這個(gè)通路依賴于TRIF轉(zhuǎn)接蛋白。先前的研究表明TRIF對(duì)LPS激活后共刺激分子的上調(diào)非常關(guān)鍵,在這篇文章中,共刺激分子上調(diào)被認(rèn)為是IFN-I受體通路的結(jié)果。然而,這篇文章主要是觀察巨噬細(xì)胞的,DCs細(xì)胞是否通過同樣的機(jī)制產(chǎn)生同樣的結(jié)果,我們不得而知。在本實(shí)驗(yàn)中,我們將探究DCs細(xì)胞識(shí)別塵螨過敏原是通過MyD88信號(hào)通路完成的還是通過TRIF通路完成的還是二者缺一不可,以及是通過哪些信號(hào)分子來觸發(fā)NF-κB的,分泌了哪些細(xì)胞因子群,為揭示樹突狀細(xì)胞參與HDM誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答提供新的依據(jù),為哮喘及其他相關(guān)過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。研究方法:第一部分:本研究共招募了31名哮喘患者和14名健康對(duì)照(HC)受試者。入院收集哮喘患者(急性加重階段)的血液,門診收集HC受試者的血液,每個(gè)個(gè)體抽取10 mL外周血置于EDTA管中。哮喘患者深度咳嗽排痰,無菌杯收集痰液,每名患者至少收集5毫升痰液。流式細(xì)胞術(shù)分析人嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá),檢測(cè)哮喘患者痰液中肥大細(xì)胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá)。BALB/c小鼠(5-6 w,18-22 g)小鼠在第0、7、14和21天皮下多點(diǎn)注射OVA溶液(含OVA 50μg、Al(OH)_3 1.5 mg)。于第25天,致敏小鼠氣管內(nèi)注射0.1 mL 5%OVA溶液(含或不含10 ng/m L IL-18)3小時(shí),然后單側(cè)肺注入1 m L的生理鹽水(含有1 mM EDTA)2 min,收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。摘除眼球收集小鼠血液,頸椎脫臼法處死小鼠,消化肺組織,流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠外周血嗜堿性粒細(xì)胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表達(dá),檢測(cè)小鼠BALF和肺組織中肥大細(xì)胞IL-18BP、IL-18R的表達(dá),夾心ELISA檢測(cè)小鼠血漿IL-18BP的水平。第二部分:收集健康對(duì)照和HDM+哮喘患者血清,利用CD14+免疫磁珠從人外周血分選CD14+單核細(xì)胞,誘導(dǎo)分化成DCs細(xì)胞。用健康對(duì)照血清、哮喘患者血清孵育DCs細(xì)胞,LPS作為陽性對(duì)照,孵育24h。收集DCs細(xì)胞,ELISA檢測(cè)DCs細(xì)胞上清IL-6的分泌情況。Western blot觀察TLR4、TLR2、MyD88、MAPKs和NF-κB的表達(dá)變化。結(jié)果:第一部分:1.HC和哮喘血液中約53%和51%的嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)IL-18,HC和哮喘血液中超過85%和81%嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)IL-18BP。然而,HC和哮喘血液中只有19.8%和8.6%的嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)IL-18R,與HC血液相比哮喘患者血液中IL-18R+嗜堿性粒細(xì)胞減少56.4%;2.CD34-FcεRIα+CD117+肥大細(xì)胞僅由約0.39%分散的有核細(xì)胞組成,僅有3.5%、14.3%和2.4%表達(dá)IL-18、IL-18BP和IL-18R。3.致敏小鼠血液中的IL-18BP+嗜堿細(xì)胞比例明顯下降,但I(xiàn)L-18R+嗜堿性細(xì)胞顯著增加;4.致敏和IL-18增加了BALF中肥大細(xì)胞的數(shù)量,IL-18增強(qiáng)了IL-18BP+肥大細(xì)胞的表達(dá);5.IL-18增強(qiáng)了OVA致敏小鼠肺中肥大細(xì)胞的數(shù)量和IL-18R+肥大細(xì)胞的百分比;6.IL-18注射使非致敏和OVA致敏小鼠的血漿中的IL-18BP水平分別增加48.0%和16.1%。第二部分:1.在HDM+哮喘患者血清的微環(huán)境下,MDDC細(xì)胞通過TLR4來識(shí)別HDME。2.單獨(dú)的HDM+哮喘患者血清即可刺激MDDC細(xì)胞MyD88表達(dá)增加,在血清中加入高劑量的HDME,MDDC細(xì)胞MyD88表達(dá)變化更為明顯。3.健康血清和哮喘血清均導(dǎo)致MDDC細(xì)胞中ERK、p38的磷酸化增加。4.HDM+哮喘患者血清對(duì)MDDC有作用,促進(jìn)NF-κB的易位。5.AS plasma+HDME 10組MDDC細(xì)胞IL-6分泌升高,SB203580和U0126均抑制了MDDC細(xì)胞IL-6的分泌。結(jié)論:第一部分:1.人外周血中50%嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)IL-18,80%嗜堿性粒細(xì)胞表達(dá)IL-18BP,嗜堿性粒細(xì)胞參與哮喘的發(fā)病與IL-18無關(guān)。2.哮喘患者痰液中僅有0.39%的有核肥大細(xì)胞,IL-18+肥大細(xì)胞比例降低,導(dǎo)致哮喘痰液中IL-18水平降低。3.致敏對(duì)小鼠肺組織肥大細(xì)胞的數(shù)目、肥大細(xì)胞IL-18BP和肥大細(xì)胞IL-18R的表達(dá)沒有影響。4.外源IL-18增強(qiáng)OVA致敏小鼠BALF和肺組織中肥大細(xì)胞以及IL-18R+肥大細(xì)胞的數(shù)目,肥大細(xì)胞通過IL-18相關(guān)機(jī)制參與哮喘的發(fā)病。第二部分:1.過敏性哮喘血清和MDDC細(xì)胞共培養(yǎng)可以模擬整體情況下的DCs細(xì)胞在哮喘微環(huán)境中的變化。2.HDME激活MDDC細(xì)胞TLR4信號(hào)通路,可能通過MyD88/ERK/p38/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文一直被用于哮喘治療�？� TNF-α，IL-4，，IL-5 和 IL-13 治療哮喘在部分臨床試驗(yàn)中已取得成功，然而，這些療法并非適用于所有哮喘患者。此外，后期惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的增加以及其他不良事件的出現(xiàn)引起了人們對(duì)于生物試劑的質(zhì)疑。因此，需要繼續(xù)尋找新的細(xì)胞因子以代替目前的治療方向。

圖 3.1 哮喘患者和 HC 受試者外周血嗜堿性粒細(xì)胞 IL-注：HC：健康對(duì)照：Asthma：哮喘。（A）代表白細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞的畫門。（B）顯示加或者不加外周血白細(xì)胞中 CD123+HLA-DR-CCR3+嗜堿性粒細(xì)胞的比IL-18、IL-18BP 和 IL-18R 的畫門。（D）顯示 IL-18+、IL-18例。（E）代表 IL-18+（a）、IL-18BP+（a）和 IL-18R+（a）嗜的代表性流式細(xì)胞圖像。（E）顯示 IL-18+、IL-18BP+和 IL-1病人（n = 31）和 HC 受試者（n = 14）的箱式圖，圖中展示了間距、最大值和最小值。*代表與 HC 組相比（P <0.05）（配對(duì)3.2 哮喘患者痰液肥大細(xì)胞 IL-18、IL-18BP 和與血漿不同[15]，哮喘患者痰液中 IL-18 水平低于是哮喘中的關(guān)鍵細(xì)胞類型之一[33]，可以產(chǎn)生一系列不
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R562.25

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本文編號(hào)：2601665