【摘要】：目的:在過去的二十年間,間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的免疫抑制功能受到了廣大學者的廣泛關(guān)注。其中,人臍帶源間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)以其來源豐富和無創(chuàng)性,成為分離獲得間充質(zhì)干細胞的重要來源。大量的研究報道顯示間充質(zhì)干細胞能夠通過細胞接觸和分泌可溶性調(diào)節(jié)物質(zhì)兩個途徑對B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK細胞以及DC進行免疫性調(diào)節(jié)。然而關(guān)于間充質(zhì)干細胞對具體的疾病尤其是食物過敏(food allergy,FA)的影響尚不清楚。本文利用小鼠OVA實驗性食物過敏模型研究了人臍帶間充質(zhì)干細胞對食物過敏小鼠臨床癥狀、腸道免疫功能及菌群的影響,從而探討間充質(zhì)干細胞對食物過敏疾病的潛在治療性應用。方法:1.人臍帶間充質(zhì)干細胞的制備與鑒定(1)將臍帶組織洗盡剃去血管,剪成細碎的組織塊,按照一定密度接種于細胞培養(yǎng)皿,放置37℃、含5%CO_2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔三天觀察并換液。當細胞生長達到約80%融合時,用含胰蛋白酶和EDTA的消化液消化并繼續(xù)傳代。(2)取第二代臍帶源間充質(zhì)干細胞,采用表面抗體染色分析其細胞表面CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14和HLA-DR抗原的表達。(3)將臍帶源間充質(zhì)干細胞按5×10~4個/cm_2接種于六孔板中。待細胞長至80%融合時,分別換為成骨分化誘導液和成脂肪分化誘導液。隔天換液,成骨誘導至28天和成脂肪誘導第14天時分別進行茜素紅染色和油紅O染色鑒定。2.間充質(zhì)干細胞對實驗性食物過敏臨床癥狀的影響(1)將20只健康BALB/c實驗鼠隨機分為四組:PBS組、FA組、FA+DMEM/F12組和FA+MSC組。分別進行食物過敏誘導和相對應的處理,記錄過程中小鼠腹瀉情況和體重變化情況。(2)食物過敏誘導和處理結(jié)束后,取出小鼠結(jié)腸組織觀察內(nèi)容物性狀并拍照。3.間充質(zhì)干細胞對小鼠腸道免疫功能的影響(1)收集小鼠血清,采用ELISA的方法檢測血清總IgE的含量。(2)流式細胞術(shù)分析小鼠外周血以及腸系膜淋巴結(jié)中TH2細胞的比例。(3)熒光定量PCR法檢測結(jié)腸固有層IL-4和TNF-α分子水平的表達。(4)結(jié)腸組織切片進行HE染色和PAS染色觀察腸絨毛和杯狀細胞變化。4.間充質(zhì)干細胞對腸道菌群的影響(1)食物過敏誘導及相應治療處理結(jié)束后,收集小鼠結(jié)腸內(nèi)容物,利用高通量Miseq測序技術(shù)以及相關(guān)分析方法,定量分析腸道內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)特征,包括OUT聚類分析、α和β多樣性分析。(2)將分析結(jié)果以門水平和屬水平分布作相對分度柱形圖。結(jié)果:(1)臍帶組織塊在培養(yǎng)12天左右,周圍出現(xiàn)梭形細胞生長。流式分析結(jié)果顯示細胞表面高表達CD73、CD90和CD105分子,但CD34、CD45、CD14和HLA-DR抗原呈陰性。體外誘導成骨、成脂肪培養(yǎng)后,細胞茜素紅染色有明顯鈣沉積物被染為紅色;油紅O染色發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)脂滴被染為橘色或紅色。(2)統(tǒng)計各組小鼠食物過敏期間體重變化無明顯的差異。但是,分析各組小鼠腹瀉的發(fā)生比例,發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞處理組小鼠腹瀉發(fā)生較晚,腹瀉比例下降。同時,食物過敏組與培養(yǎng)基對照組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物不成形,而間充質(zhì)干細胞處理組則相對較成形。(3)食物過敏后,小鼠血清總IgE水平明顯增加,而間充質(zhì)干細胞處理后則發(fā)生顯著的下降;同時外周血與腸系膜淋巴結(jié)中TH2細胞的分化受到壓制。熒光定量PCR結(jié)果顯示,治療組的IL-4和TNF-α在結(jié)腸固有層的表達水平下降。結(jié)腸組織切片顯示治療組的腸絨毛水腫和炎癥細胞浸潤減輕,同時杯狀細胞的增生減低。(4)菌群分析結(jié)果表明,間充質(zhì)干細胞處理組小鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)較實驗組和培養(yǎng)基對照組有一定的恢復,其中,擬桿菌門明顯增多,變形菌門顯著下降。結(jié)論:間充質(zhì)干細胞的應用改善了食物過敏小鼠的臨床癥狀,其免疫抑制功能一定程度上抑制了小鼠體內(nèi)過敏反應的發(fā)生,并且對小鼠腸道菌群有較好的恢復效應。
【圖文】：

人臍帶間充質(zhì)干細胞對 OVA 實驗性食物過敏的影響療等方面都有廣泛的應用前景，甚至已經(jīng)取得成就[13, 14]。另外，在獲得性免疫和固有免疫方面，，間充質(zhì)干細胞也具有較強的免疫抑制作用[15, 16]，主要表現(xiàn)在對參與獲得性免疫的 T 細胞和 B 細胞以及參與固有免疫的 DC 和 NK 具有免疫抑制作用[17]。

MSCs與T細胞的相互作用
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R593.1

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本文編號：2600472