【摘要】：糖尿病(Diabetesmellitus,DM)可以引起以輕、中度認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力下降為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,稱為糖尿病腦病(Diabetic encephalopathy,DE)。老年糖尿病患者患癡呆的風(fēng)險是正常同齡人的2倍左右。目前全世界糖尿病患者已高達(dá)3.5億,老年人群中2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患病率可達(dá)10%以上,并且約半數(shù)以上伴有學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知能力的降低。DE兼具腦血管病變和阿爾茲海默病樣改變,發(fā)病原因復(fù)雜,病理機制仍不清楚。目前認(rèn)為糖尿病腦微環(huán)境例如高糖、高膽固醇、高甘油三酯、高脂肪酸、胰島素信號紊亂等對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元及其支持細(xì)胞的損傷是誘發(fā)DE的重要因素。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多、功能最廣泛的一類神經(jīng)細(xì)胞,對腦內(nèi)離子水平穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和攝取、神經(jīng)元生長發(fā)育和信息傳遞有重要作用。隨著研究的深入,基于神經(jīng)元及其支持細(xì)胞病變的機制已逐漸成為DE探究的重點。在課題組以前的研究基礎(chǔ)上,本研究分別考察糖尿病腦微環(huán)境的高脂或高糖狀態(tài)對原代培養(yǎng)神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響,并對其損傷機制進(jìn)行深入研究。工作主要分為以下三個部分:第一部分高糖、高脂對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響通過體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的葡萄糖(Glucose,G)或棕櫚酸(Palmitic Acid,PA)損傷模型,模擬糖尿病腦病時高游離脂肪酸(Free fatty acid,FFA)和高葡萄糖的腦部微環(huán)境對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用,以期找出DE發(fā)病過程中的關(guān)鍵病理因素。本實驗從出生12h以內(nèi)的Wistar乳鼠海馬或皮層組織分離培養(yǎng)原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。特異性標(biāo)記蛋白免疫熒光染色實驗表明,原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度大于98%,神經(jīng)元細(xì)胞純度大于95%,且生長狀態(tài)良好。高葡萄糖損傷實驗分別采取35mmol·L-1高濃度G、17.5mmol·L-1中濃度G、5.5mmol·L-1低濃度的G、5.5mmol·L-1低濃度G加上17.5mmol·L-1甘露醇(Mannitol,M)的培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞,24h、48h和72h后MTT方法檢測細(xì)胞活性。高脂肪酸損傷實驗分別采取0.1mmol·L-1的高濃度PA、0.05mmol·L-1的中濃度PA、0.01mmol·L-1的低濃度的PA、不含PA的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞,24h、48h和72h后MTT方法檢測細(xì)胞活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高糖對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有顯著的損傷作用,35mmol·L-1 G損傷72h后使星形膠質(zhì)細(xì)胞活性降低20%,高糖對神經(jīng)元無明顯影響;高脂對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有顯著的損傷作用,O.1mmol·L-1 PA損傷72h后細(xì)胞活性降低51%,高脂對神經(jīng)元無明顯影響。表明FFA損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞可能是DE的重要病理機制。第二部分棕櫚酸引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的機制研究第一部分的研究發(fā)現(xiàn)FFA損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞可能在DE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,本部分主要對FFA損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的機制進(jìn)行更加深入的探索。使用 TUNEL 染色法(TdT-mediated dUTPNick-End Labeling,TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)PA可濃度依賴性的誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞對熒光標(biāo)記PA類似物BODIPYFLC16的攝取,結(jié)果表明分化抗原決定簇36(Cluster of differentiation 36,CD36)在星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取脂肪酸過程中發(fā)揮重要作用。采用鈣離子熒光染料和FLIPR實時熒光記錄系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化,發(fā)現(xiàn)PA可引起IP3R(Inositol trisphosphate receptor,IP3受體)介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣衰竭。通過CM-H2DCFDA熒光染色檢測細(xì)胞內(nèi)氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)水平,結(jié)果表明PA可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平顯著增加。CD36抑制劑N-油�；虼牾啺�(sulfo-N-succinimidyl oleate,SSO)可以減少PA的攝取及其誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣超載,ROS水平升高,線粒體損傷,細(xì)胞活性下降和細(xì)胞凋亡,谷氨酸攝取能力下降,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)合成和分泌減少。IP3R 抑制劑二苯基硼酸-2-氨基乙酯(2-aminoethyldiphenylborinate,APB)也可以抑制PA引起的鈣超載和ROS水平升高。CD36抑制劑SSO、IP3R抑制劑APB和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)對PA引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞活性下降均具有顯著抑制作用。綜上所述,CD36通過鈣超載和氧化應(yīng)激介導(dǎo)PA誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。第三部分神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞對棕櫚酸損傷敏感性差異的機制研究第一部分的研究發(fā)現(xiàn)高脂肪酸顯著損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞,對神經(jīng)元無明顯影響。第二部分的研究表明脂肪酸通過CD36介導(dǎo)的鈣超載和氧化應(yīng)激引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。本部分在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上著重探討星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元對脂肪酸損傷敏感性不同的分子機制。通過Western-blot和流式細(xì)胞技術(shù)檢測脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞CD36表達(dá)量約為神經(jīng)元的2.1倍。進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種細(xì)胞對熒光標(biāo)記PA類似物BODIPYFLC16的攝取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞對PA的攝取率約為神經(jīng)元的6.4倍。PA可以強烈促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放,與星形膠質(zhì)細(xì)胞相比PA促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放作用較弱,相同的條件下PA損傷可以使星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣含量下降約80%而神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣含量下降約25%。由此可見CD36表達(dá)量決定星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元對脂肪酸損傷的敏感程度。轉(zhuǎn)染CD36-pcDNA3.1質(zhì)粒,使神經(jīng)元過表達(dá)CD36之后,PA對神經(jīng)元的損傷作用顯著增強。轉(zhuǎn)染CD36siRNA,使星形膠質(zhì)細(xì)胞CD36表達(dá)減少,PA對星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用顯著減弱。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.2

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本文編號：2598917